血清同型半胱氨酸水平與單核細胞亞型及頸動脈動脈粥樣硬化斑塊穩定性的相關性

吳 燕 姜烜星 王雪梅 王 麗

1.河西學院附屬張掖人民醫院健康管理中心，甘肅張掖 734000；2.河西學院附屬張掖人民醫院檢驗中心，甘肅張掖 734000

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）是動脈粥樣硬化及血栓形成的風險因素[1,2]。研究發現，約40%的心腦血管疾病患者合并HHcy，而健康群體中僅有15%合并HHcy[3]。研究顯示同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）可能參與動脈粥樣硬化斑塊生成及脫落為血栓的過程，但其致斑塊穩定性變化的機制目前尚不明確[4]。Hcy 可誘導單核細胞向炎癥型分化，并產生促炎作用，而炎癥型單核細胞是動脈粥樣硬化進展的關鍵細胞[1]。因此，HHcy可能與單核細胞亞群的比例有相關性，且參與調節動脈粥樣硬化患者的斑塊穩定性。本研究擬探討血清Hcy 水平與單核細胞等動脈粥樣硬化危險因素之間的相關性，并分析Hcy 與單核細胞亞型、斑塊穩定性之間的關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2020 年11 月至2022 年2 月于河西學院附屬張掖人民醫院健康管理中心體檢的246 例體檢者進行回顧性隊列研究，納入對象年齡40～70 歲，根據超聲檢查有無頸動脈斑塊及斑塊性質，將其分為健康對照組（無頸動脈斑塊，40 例）、穩定斑塊組（101例）和不穩定斑塊組（105 例）。頸動脈斑塊的診斷參照《中國腦卒中血管超聲檢查指導規范》[5]：內-中膜厚度（intimal medial thickness，IMT）≥1.5mm，凸出于血管腔內，或局限性內膜增厚高于周邊IMT的50%時，定義為動脈粥樣硬化斑塊形成。其中扁平斑、硬斑為穩定斑塊，軟斑、潰瘍斑為不穩定斑塊，同時存在穩定斑塊和不穩定斑塊者歸為不穩定斑塊。排除既往有明確冠心病、糖尿病病史者；曾行冠狀動脈支架植入術或旁路移植術者；合并各種急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、造血功能障礙、H 型高血壓、肝腎功能障礙者；使用降血脂藥物、糖皮質激素等其他影響免疫系統或造血功能的藥物者。

1.2 觀察指標

主要觀察指標包括血脂指標、Hcy、單核細胞比例。為進一步統計分析，將以下變量定義為分類變量：Hcy≥15.0μmol/L 為高Hcy，Hcy＜15μmol/L 為正常Hcy，單核細胞比例＞8%為單核細胞升高，3%～8%為正常水平。血常規檢查由希森美康醫用電子（上海）有限公司生產的XN9000 全自動血細胞分析儀測定。生化項目由西門子醫學診斷產品（上海）有限公司生產的ADV IA2400 全自動生化分析儀測定。

1.3 外周血單個核細胞的提取和儲存

患者超聲檢查當天，收集血液提取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。全血3000 轉/min 離心15min 去除血漿，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）1 ∶1 稀釋，并在Ficoll-Paque 上、25℃下2000 轉/min 離心20min。從中間相中提取PBMC，PBS 洗滌3 次，每次10min。將PBMC 手動重懸于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640 培養基中并儲存于–80℃。

1.4 流式細胞術分析

另招募30 例頸動脈斑塊患者（穩定斑塊15 例、不穩定斑塊15 例）采用流式細胞術檢測單核細胞分型，并分析其與血清Hcy 水平的關系。根據國際免疫學會對單核細胞的分類，基于單核細胞表面CD14和 CD16 的表達強度，將單核細胞分為炎癥型（CD14++CD16-）和定居型（CD14+CD16+）。流式分析數據采用Flowjo 10.4 軟件進行處理。

1.5 統計學方法

應用Graphpad Prism 8.0 統計軟件進行數據分析和圖像繪制。正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用獨立樣本t檢驗和方差分析，不服從正態分布的則以中位數（四分位數間距）[M（Q1，Q3）]表示，比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。采用Spearman 和Pearson 相關性分析法分析Hcy 與血脂指標的相關性；計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組研究對象的臨床特征比較

三組研究對象的年齡、性別、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、載脂蛋白B 比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；吸煙＞5 年、Hcy≥15μmol/L比例、Hcy、單核細胞比例、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、載脂蛋白A 比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組研究對象的臨床特征比較

2.2 血清Hcy 與血脂及單核細胞比例的相關性分析

相關性分析結果顯示，血清Hcy 水平與單核細胞比例、TC、TG、LDL、載脂蛋白A、載脂蛋白B水平均呈較弱的正相關（P＜0.05），而與HDL 水平呈弱的負相關（P＜0.05），見表2。

表2 血清Hcy 水平與血脂及單核細胞比例的相關性分析

2.3 單核細胞亞型對頸動脈斑塊性質的影響

不穩定斑塊組的單核細胞總數量、炎癥型單核細胞數量、血清Hcy 水平均顯著高于穩定斑塊組（P＜0.05），見表3。相關性分析結果顯示，炎癥型單核細胞與血清Hcy 水平呈弱的正相關（r2=0.664，P＜0.001），見圖1。

表3 不同頸動脈斑塊性質的單核細胞亞型數量及Hcy 水平比較（）

表3 不同頸動脈斑塊性質的單核細胞亞型數量及Hcy 水平比較（）

圖1 炎癥型單核細胞與Hcy 水平的相關性

3 討論

頸動脈粥樣硬化斑塊是腦血管血栓栓塞的主要來源，不穩定斑塊的形成與炎癥密切相關。不穩定斑塊的形成可增加腦梗死的發病風險。腦梗死致殘率高，嚴重危害人類健康，并增加社會和家庭的經濟負擔[6]。研究發現，HHcy 增加血管炎性反應及斑塊面積，血清Hcy 水平每升高5μmol/L，則心血管疾病風險增加1.6～1.8 倍[7]。本研究顯示，不穩定斑塊組患者的血清Hcy 水平高于穩定斑塊組和健康對照組，穩定斑塊組患者的血清Hcy 水平高于健康對照組，這與石程程等[6]研究結果一致。

近年來，大量研究證實動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥過程[8-12]。為此，筆者分析了不同組間Hcy 水平與血脂指標之間的關系，進一步為Hcy 水平升高與斑塊穩定性密切相關提供解釋。本研究相關性分析發現血清Hcy 水平與TC、TG、LDL、載脂蛋白A、載脂蛋白B 水平具有較弱的正相關，與HDL 水平具有弱的負相關。這一現象可通過Ravnskov 等[13]的假說來解釋。該假說認為，不穩定斑塊起源于與微生物復合的脂蛋白聚集體造成的血管阻塞，而這一過程因Hcy 硫代內酯聚集脂蛋白而加劇發展。HHcy 導致血管內皮功能障礙、血管阻塞，造成動脈壁缺血、壁內細胞死亡、毛細血管破裂，繼而動脈內膜內微生物釋放，引起出血、炎癥，最終導致不穩定斑塊形成。

單核細胞是免疫效應細胞，是動脈粥樣硬化形成過程中最常見的炎癥細胞，是斑塊重要組成部分，同時也是易損斑塊形成的重要病理生理學基礎。在動脈粥樣硬化斑塊形成的過程中，外周血單核細胞遷移至動脈內膜下，分化為巨噬細胞，攝取氧化的LDL，從而構成動脈粥樣硬化病變的核心并導致不穩定斑塊的形成[14]。近年來，研究顯示炎癥型單核細胞在動脈硬化粥樣斑塊形成與破裂過程中至關重要；相反，定居型單核細胞在病變早期可通過抑制局部炎癥及延緩斑塊進展、在斑塊破裂后通過抑制血栓形成及促進新生血管生成等途徑改善局部心肌灌注。有研究認為白細胞及其亞型數目與梗死灶周圍炎性反應、強度和斑塊穩定性相關[6,15-17]。然而，有關斑塊穩定性和單核細胞分型及亞型的比例之間是否具有一定關系卻很少被人研究，現有研究主要集中在單核細胞與早期疾病階段之間的關聯，例如頸動脈內膜中層厚度[18]。本研究通過回顧性分析246例體檢者的病歷資料，研究血清Hcy 水平與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性及其獨立風險因素之間的關系；通過募集的30 例頸動脈斑塊患者的血液樣本，分析單核細胞亞型、斑塊穩定性、血清Hcy 水平之間的聯系。相比于穩定型斑塊患者，不穩定斑塊患者的總CD14+單核細胞和炎癥型單核細胞增加，而定居型單核細胞未見明顯變化；提示Hcy 可能促進循環單核細胞向炎癥型分化，進而通過局部產生炎癥因子和蛋白酶來促進不穩定斑塊的形成。本研究以觀察性研究為主，暫尚無直接證據來確定因果關系，還需今后通過動物模型及大樣本量研究進一步驗證。