GPR30 激動劑對Aβ1-42 所致認知功能障礙的治療作用及其機制研究

呂揚歌 吳凌智

嘉興市第一醫院（嘉興學院附屬醫院）藥學部，浙江嘉興 314000

據統計，阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者中，絕經期女性的發病率約為同年齡段男性的3 倍[1]，且其發病率與絕經后雌激素水平相關[2]。雌激素替代治療可顯著減少AD 患者大腦β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積，減輕神經元炎性反應和凋亡，對患者的認知功能也有顯著改善作用[3,4]。然而，雌激素在治療認知功能障礙的同時，也會增加乳腺、子宮、卵巢等腫瘤發病的風險[5,6]。雌激素的功能主要通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）介導，ER 有兩種亞型：ERα 和ERβ，其中ERα 大量分布于子宮、卵巢等生殖器官，當與雌激素結合后，極易引發相關腫瘤[7,8]。2000 年，Filardo 等[9]發現一種新的G 蛋白耦聯受體（G protein coupled receptor，GPR）可被17β 雌二醇結合，并發揮快速非基因組效應，該受體被命名為GPR30。GPR30 廣泛表達于多種細胞，獨立介導雌激素的非基因組效應的特點使其成為可避免雌激素治療引起腫瘤風險、同時發揮認知功能改善作用的潛在靶點。cAMP 效應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一種在神經細胞內廣泛表達的調節基因轉錄的蛋白質，在神經元生長發育、神經突觸形成及細胞修復等神經生理活動中起關鍵作用，其被激活后可調節下游基因如腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及凋亡相關基因（如Bcl-2、Bax、caspase-3 等）的表達[10,11]。研究證實，雌激素可激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路并進一步激活CREB，而這一作用在無ER 的細胞系中也同樣存在[12]，鑒于此，筆者推測GPR30 可通過上述信號通路影響AD 的病理過程，給予GPR30激動劑G1 可能通過與GPR30 受體結合，從而激活CREB/BDNF 通路影響神經元凋亡、再生功能，從而發揮抗AD 作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性SPF 級ICR 小鼠由南京青龍山動物飼養廠提供，體質量22～24g，小鼠可自由獲取水和食物。將ICR 小鼠飼養到6 月齡后，按照體質量進行隨機分組，分為對照組、模型組、陽性對照組、G1 低劑量組、G1 中劑量組、G1 高劑量組，每組各12 只。本研究經嘉興學院醫學院實驗動物倫理委員會批準[倫理審批編號：JUMC2020-013；動物實驗許可證編號：SYXK（浙）2020-007]。

1.2 主要試劑

Caspase-3、Bcl-2、Bax、CREB、p-CREB、BDNF抗體及山羊抗兔二抗購自美國Affinity Biosciences公司，G1 購自美國MedChemExpress 公司，Aβ1-42購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 動物模型的建立

將ICR 小鼠用水合氯醛（17.5mg/ml）麻醉后固定在立體定位儀上，坐標為距前囟2.0mm、距中線1.5mm、深度 2.0mm。將含有或不含有 Aβ1-42（410pmol/小鼠）的磷酸鹽緩沖鹽水（5μl）注射到雙側海馬體中（每側2.5μl，輸注速度1μl/min），輸注完畢后留針2min。

1.4 動物給藥

造模結束48h 后，ICR 小鼠每日給予相應藥物或溶劑（0.5%羥甲基纖維素鈉），連續給藥4 周。藥物均使用0.5%羥甲基纖維素鈉配制成混懸劑，現用現配。給藥劑量：陽性對照組灌胃給予鹽酸多奈哌齊1mg/kg；G1 低、中、高劑量組分別腹腔注射給予1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg 的GPR30 激動劑G1；對照組和模型組給予等體積的溶劑。

1.5 行為學實驗

1.5.1 Morris 水迷宮實驗 整個實驗分為三個階段：①可見平臺訓練期為期2d：逃生平臺固定放置于某處水面以下1cm，并在平臺旁豎一面小旗標（高5cm）。小鼠每日進行4 次實驗，每次實驗間隔1h。當小鼠到達逃生平臺時實驗結束，記錄小鼠到達逃生平臺所需時間（逃避潛伏期）。若小鼠在90s 內未能找到平臺則測試結束，并引導小鼠置于平臺30s。②隱藏平臺訓練期為期3d：訓練過程中，取下旗幟，其余同可見平臺訓練期。③第6 天為空間探索實驗：撤去逃生平臺，開始探索實驗。小鼠從任一象限開始，面朝池壁放入水中，統計小鼠90s 內在平臺目標象限停留時間百分比和穿越原平臺位置次數。

1.5.2 避暗實驗 Morris 水迷宮實驗結束后間隔24h 進行避暗實驗。實驗分為2 天，第1 天為訓練期，將小鼠腹朝拱門放入明箱，關閉箱底交流電讓小鼠適應環境2min，然后打開暗箱底部交流電，重新將小鼠腹朝拱門放入明箱，記錄5min 內小鼠的逃避潛伏期和錯誤次數，作為訓練成績；第2 天為測試期，再次將小鼠腹朝拱門放入明箱，記錄5min 內小鼠的逃避潛伏期和錯誤次數，作為測試成績。若5min 內小鼠未進入暗箱，則逃避潛伏期記為300s，錯誤次數記為0 次。

1.5.3 新物體識別實驗 實驗過程分為適應期、熟悉期和測試期。在第1 天適應期時，每組小鼠均依次放入曠場箱中適應5min。第2 天熟悉期則需將兩個相同的物體分別放入曠場箱的左右兩側，每組小鼠于箱中適應5min。第3 天為測試期，將第2 天放入曠場箱中2 個相同物體的其中一個更換為新物體后，將小鼠放入曠場箱中進行測試。統計小鼠對熟悉物體A 及新物體B 的探索時間EA、EB，計算小鼠的識別指數（discrimination index，DI），DI=（EB-EA）/（EA+EB）。

1.6 蛋白質印跡法檢測

小鼠脫頸處死后迅速提取海馬組織樣本，提取蛋白，采用蛋白質印跡法檢測小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax、caspase-3、BDNF、CREB、p-CREB 的表達水平，分析GPR30 對神經元凋亡和再生的調節作用及機制。

1.7 統計學方法

使用SPSS 20.0 軟件對數據進行處理和分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GPR30 激動劑可改善Aβ1-42小鼠認知功能障礙

Morris 水迷宮實驗中，小鼠在可見平臺測試第1天中表現出相似的逃避潛伏期，表明給予Aβ1-42或G1對小鼠的視力或基礎動力無顯著影響（P＞0.05），見圖1A。隱藏平臺訓練期數據顯示，各組小鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短，訓練期第5 天，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著長于對照組（P＜0.001），G1 中、高劑量組小鼠的逃避潛伏期均顯著短于模型組（P＜0.05），見圖1A。在空間探索實驗中，與對照組相比，模型組小鼠的目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數顯著降低（P＜0.05）；G1 高劑量組小鼠上述兩個指標均顯著高于模型組（P＜0.05），見圖1B、圖1C。

避暗實驗中，對照組小鼠的錯誤次數顯著少于模型組（P＜0.001），避暗潛伏期顯著長于模型組（P＜0.01）；G1 中、高劑量組小鼠的錯誤次數均顯著少于模型組（P＜0.05），避暗潛伏期均顯著長于模型組（P＜0.05），見圖1D、圖1E。

新物體識別實驗中，模型組小鼠的DI 顯著低于對照組（P＜0.01）；G1 中、高劑量組小鼠的DI 均顯著高于模型組（P＜0.05），見圖1F。

圖1 GPR30 激動劑對Aβ1-42誘導的小鼠認知功能障礙的作用

2.2 GPR30 激動劑抑制Aβ1-42小鼠海馬組織凋亡相關蛋白的表達

與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中的Bcl-2/Bax 比例降低，活化的caspase-3/pro-caspase-3 的比例升高（P＜0.001）；G1 高劑量組小鼠海馬組織中的Bcl-2/Bax 比例顯著高于模型組（P＜0.05），G1 中、高劑量組小鼠活化的caspase-3/pro-caspase-3 的比例均顯著低于模型組（P＜0.05），見圖2。

圖2 GPR30 激動劑對小鼠海馬組織中caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達水平的影響

2.3 GPR30 激動劑增加 Aβ1-42 小鼠海馬組織中p-CREB/CREB 和mBDNF/proBDNF 的比例

與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中的p-CREB/CREB 水平顯著低于對照組（P＜0.01）；G1 高劑量組小鼠海馬組織中的p-CREB/CREB 水平顯著高于模型組（P＜0.05）。模型組小鼠海馬組織中的 mBDNF/proBDNF 的比例顯著低于對照組（P＜0.001），G1 高劑量組小鼠海馬組織中的mBDNF/proBDNF 的比例顯著高于模型組（P＜0.05），見圖3。

圖3 GPR30 激動劑對小鼠海馬組織中CREB 和BDNF 表達水平的影響

3 討論

AD 的病因復雜多樣，目前還未能得出統一結論，但AD 患者的神經病理學改變幾乎完全一致，主要表現為腦內出現老年斑和神經原纖維纏結，大腦皮層和海馬回神經元丟失及突觸數量減少等[13-15]。在這些病理改變的基礎上提出一系列AD 發病機制的假說，包括Aβ 級聯假說、慢性炎癥假說、Tau 蛋白假說等[14,16]。其中Aβ 級聯假說被認為是AD 發病最關鍵的因素，受到廣泛認可[17]。Aβ 是Master 等[18]在1985 年首次從老年斑中分離出的核心成分，在正常生理條件下，Aβ 的生成和代謝處于動態平衡，但當多種因素引起Aβ 代謝平衡紊亂時，Aβ 可在大腦皮層和海馬區域出現異常增多和沉積，引發突觸變化、神經元損傷、炎性反應、神經遞質丟失等，最終導致大腦功能失調，產生認知功能障礙[19]。目前已證實的AD 相關高發基因的變異均與Aβ 的異常增多和沉積有關[16]。

本研究采用Aβ1-42腦室注射誘導產生小鼠AD 模型，通過行為學實驗和相關蛋白檢測研究GPR30 對AD 所致的認知功能障礙和神經元損傷的作用。在水迷宮實驗等行為學實驗中，模型組小鼠的認知能力較對照組小鼠顯著降低，給予G1 后可顯著逆轉Aβ1-42的這一作用，提示GPR30 激動劑G1 可顯著改善Aβ1-42所致的小鼠認知功能障礙。

神經元凋亡是AD 引起認知功能障礙的最主要原因，研究表明Aβ1-42在腦部的聚集會產生多種神經毒性效應，如神經炎癥、神經元凋亡、興奮性毒性、鈣穩態破壞、Tau 蛋白高度磷酸化等，導致AD 患者的神經元大量丟失，最終導致患者的認知功能進行性下降。在AD 發生早期，即可在AD 患者大腦中觀察到Aβ 的沉積及其引起的氧化應激、炎癥和神經細胞凋亡[20]。在此過程中，caspase-3、Bcl-2、Bax 扮演著重要的調控角色，為初步探究GPR30 激動劑對Aβ1-42所致小鼠認知功能障礙改善的潛在機制，對小鼠海馬和皮層組織中的凋亡及神經營養相關蛋白表達水平進行檢測，結果顯示，Aβ1-42可引起p-CREB/CREB、mBDNF/proBDNF、Bcl-2/Bax 降低，激活caspase-3，導致小鼠神經元凋亡。而GPR30 激動劑G1 可顯著逆轉由Aβ1-42引起的這一系列凋亡和神經營養相關蛋白的變化。

綜上所述，給予GPR30 激動劑可顯著改善AD模型鼠的認知功能，逆轉Aβ1-42所致神經元凋亡，促進神經元再生，這一作用的分子機制可能是通過激活CREB/BDNF 通路，進而調節Bcl-2、Bax、caspase-3和BDNF 的表達水平，從而發揮抗AD 作用。這些發現為GPR30 在Aβ1-42誘導的認知障礙和細胞凋亡中的作用提供了新的見解。同時也為我們進一步研究GPR30 改善AD 所致的認知功能障礙的分子機制提供了重要的實驗基礎和參考依據。