氮水平對(duì)雪菊幼苗中黃酮類化合物和礦質(zhì)營養(yǎng)累積的影響

李志元，江虹，馬艷，姜秀梅，張力方，梁志國，王澤鵬，唐亮，梁肖，秦勇*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所，烏魯木齊 830091）

雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）起源于美國中西部地區(qū)，屬于菊科金雞菊屬一年生草本植物，我國主產(chǎn)區(qū)在新疆和田地區(qū)。雪菊花中含有豐富的黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、降三高等多種藥理療效[1]。研究證明，雪菊中的黃酮類物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于市售的其他菊花品種[2]，在花茶市場中顯示出了特有的藥用價(jià)值。因此，深入研究和改善雪菊中黃酮類物質(zhì)積累的農(nóng)業(yè)措施對(duì)雪菊產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展以及促進(jìn)人類健康具有重要意義。

黃酮類物質(zhì)作為食品和傳統(tǒng)藥物的重要成分，在人體體內(nèi)或體外系統(tǒng)中均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可減緩?fù)诵行约膊?duì)人體的危害[3-5]，如槲皮素是常見的黃酮類化合物，它可以降低脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化和活性氧水平[6]；木犀草素可保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，改善記憶力，并通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡達(dá)到抗腫瘤作用[7]；蘆丁具有降低血糖、尿糖和血脂等功效[8]。目前，關(guān)于改善雪菊中黃酮類物質(zhì)積累的研究報(bào)道還十分有限。

環(huán)境因子能誘導(dǎo)植物中黃酮類化合物的生物合成和積累，一些植物中缺氮誘導(dǎo)了黃酮類物質(zhì)顯著增加，如菊花[9]、青錢柳[10]和擬南芥[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低氮水平可誘導(dǎo)雪菊葉片（或莖）黃酮類化合物的積累，且其積累與苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活性密切相關(guān)[12]。在藥用植物、果蔬以及大田作物的栽培系統(tǒng)中，施氮肥可以促進(jìn)生物量的增加，同時(shí)減少黃酮類、萜類物質(zhì)等生理活性物質(zhì)的生物合成和積累，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量和目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。在此過程中，植物體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)（包括磷、鉀、鈣、鎂、銅、鐵）的變化可能參與了黃酮類物質(zhì)的積累，然而目前涉及兩者相關(guān)性的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以采自和田地區(qū)克里陽鄉(xiāng)的昆侖雪菊種子為材料，設(shè)置5個(gè)氮素處理水平并進(jìn)行水培試驗(yàn)，在人工控制條件下，探討雪菊幼苗黃酮類化合物的積累與氮素水平以及植株內(nèi)部礦質(zhì)營養(yǎng)積累的關(guān)系，為促進(jìn)雪菊黃酮類化合物的積累以及建立雪菊最佳種植策略提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所的連棟溫室內(nèi)進(jìn)行。雪菊種子于2019年在新疆皮山縣克里陽鄉(xiāng)采集。首先對(duì)雪菊種子仔細(xì)篩選；然后采用Fang等[13]的方法利用外源赤霉素對(duì)種子進(jìn)行處理。雪菊穴盤育苗的基質(zhì)為蛭石與珍珠巖（2∶1）。

雪菊幼苗在穴盤培養(yǎng)25 d后，即幼苗長至4片真葉時(shí)，用海綿塊包裹植株根系，定植于含有8 L營養(yǎng)液的培養(yǎng)箱中。定植7 d后進(jìn)行氮素處理。設(shè)置5個(gè)氮素施用水平，分別為0（N1）、0.625（N2）、1.250（N3）、2.500（N4）和5.000（N5）mmol·L-1Ca(NO3)2。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30株，處理30 d后取樣用于相關(guān)指標(biāo)的測定。營養(yǎng)液成分包 括：160 mg·L-1Ca（NO3）2、408 mg·L-1KH2PO4、136 mg·L-1CaSO4、120 mg·L-1MgSO4、8.4 mg·L-1EDTA-Fe（乙 基 二 胺 四 乙 酸）、3.8 mg·L-1KCl、1.6 mg·L-1H3BO3、0.3 mg·L-1MnSO4、0.3 mg·L-1ZnSO4、0.1 mg·L-1CuSO4、0.1 mg·L-1Na2MoO4，并用NaOH或HCl將營養(yǎng)液pH調(diào)至7.0±0.1。培養(yǎng)期間，每隔2天用營養(yǎng)液對(duì)所散失的水分進(jìn)行補(bǔ)充，每5天更換一次營養(yǎng)液；保持幼苗培養(yǎng)期間氧氣泵24 h不間斷工作，30 d后采收材料，光強(qiáng)設(shè)置為620μmol·m-2·s-1，光周期為12 h，晝夜溫度分別為25和15℃，并保持幼苗在60%恒定相對(duì)濕度的條件下生長。

1.2 測定方法

1.2.1 植株碳和氮的測定 將樣品（包括根、莖、葉）在70℃條件下完全干燥后磨成粉末，冷卻至室溫，取1 mg樣品粉末置于錫罐（2 mm×5 mm）中采用元素分析儀（EA3000，意大利）測定幼苗總碳（carbon，C）和氮（nitrogen，N）含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 礦質(zhì)元素的測定 使用原子吸收分光光度法測定磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、銅（Cu）和鐵（Fe）等礦質(zhì)元素的含量[14]。首先稱取樣品粉末0.2 g置于消解管中，加入7 mL HNO3和HClO4（V∶V=2∶1）消化液進(jìn)行消化，控制溫度，使消煮液保持沸騰，當(dāng)液體呈現(xiàn)透明且沒有糊狀時(shí)表示消煮完畢，之后將其冷卻至常溫。將消解后的溶液過濾至50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻，待測。

1.2.3 株高和生物量的測定 在樣品采收時(shí)測定幼苗的株高，同時(shí)對(duì)生物量進(jìn)行分析。所有樣品在70℃條件下干燥后稱重。生物量為植株根、莖和葉的總干質(zhì)量。

1.2.4 黃酮類物質(zhì)測定 根據(jù)Liu等[9]的方法測定雪菊中總黃酮含量。將葉、根和莖的新鮮組織各0.5 g分別置于70%乙醇中35℃超聲處理45 min，用比色法測定其含量；將1 mL溶液和5 mL去離子水加入到25 mL的試管中，在該反應(yīng)混合物中加入1 mL 5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）NaNO2，在室溫下保持6 min；然后加入1 mL 10%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）AlCl3·6H2O，置于室溫下再保持6 min；然后加入1 mL 1 mol·L-1NaOH，用去離子水將最終體積定容至25 mL。在512 nm處立即讀取溶液的吸光度。

對(duì)根、莖、葉組織進(jìn)行木犀草素、槲皮素、蘆丁共3種黃酮類化合物單體的分析。取完全研磨樣品1.0~2.0 g置于15 mL加入甲醇（80%）的棕色離心管中，振蕩混合5 min，超聲提取3 min，4 000 r·min-1離心15 min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，重復(fù)提取2次；收集上清液，最后用5 mL 20%乙腈水溶解，振蕩樣品。上清液通過45μm過濾器過濾以供進(jìn)一步分析。

采用Agilent-1200系列高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系 統(tǒng)（美國加利福尼亞州安捷倫農(nóng)業(yè)技術(shù)公司）進(jìn)行分析，該系統(tǒng)配備了真空除氣器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和二極管陣列檢測器，并連接到Agilent化學(xué)站軟件。在AgilentEclipsexdb-c18柱（4.6 mm×250 mm，I.D.3.5μm）分離，柱溫保持在30℃。用0.2%甲酸（A）和乙腈（B）的梯度洗脫，以1 mL·min-1的流速分離分析物。梯度洗脫為：0~5 min，10~15%B；5~15 min，15~22%B；15~25 min，22~48%B；最后分別在260和320 nm處測定吸光度。采用木犀草素、槲皮素和蘆丁（中國北京國家藥物和生物制品控制研究所）標(biāo)準(zhǔn)品建立校準(zhǔn)曲線。

1.2.5 酶活性測定 使用ELISA試劑盒測定PAL、肉 桂 酸 4-羥 化 酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumaric acid CoA ligase，4CL）、查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、黃 烷 酮3-羥 化 酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）和類黃酮合成酶（flavonoid synthase，F(xiàn)LS）活性。用純化的植物PAL（或C4H，4CL，CHS，F(xiàn)3H，F(xiàn)LS）抗體涂敷微滴板井，然后將PAL加入井中形成抗體抗原酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物。樣品孔完全洗滌后，加入TMB底物溶液，37℃孵育15 min。然后用濃硫酸溶液終止反應(yīng)，在450 nm處讀取吸收值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，采用用SPSS21.0分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮素處理對(duì)雪菊幼苗碳和氮含量及碳/氮的影響

對(duì)幼苗根、莖、葉中碳、氮含量進(jìn)行測定，計(jì)算碳/氮值，結(jié)果（表1）表明，隨著氮素施用水平的增加，根、莖、葉中氮含量顯著提高（P＜0.05），增幅分別為1.0%~1.9%、0.8%~1.5%和1.6%~2.6%；而根、莖、葉中碳含量相對(duì)穩(wěn)定，除N5處理葉片碳含量顯著降低，其余處理間均無顯著差異。隨著氮素施用水平的增加，根、莖、葉中氮含量的線性增加導(dǎo)致碳/氮比值顯著下降（P＜0.05）。與N1處理相比，N5處理根、莖和葉中的碳/氮值分別下降了46.2%、49.4%、44.4%。

表1 不同氮素水平下雪菊幼苗根、莖和葉片中碳、氮含量及碳/氮比Table 1 Concentsof carbon，nitrogen and carbon/nitrogen in root，stalk and leaf of Coreopsistinctoria under different treatment

2.2 不同氮素處理對(duì)雪菊幼苗P、K、Ca、Mg、Cu、Fe含量的影響

在不同氮素處理下，幼苗根、莖和葉片中P、K、Ca、Mg、Cu、Fe含量如圖1所示。不同氮素處理葉片中P含量為1 480.29~2 422.77 mg·kg-1；莖和根中P含量分別為1 087.82~1 873.60和1 619.95~3 008.64 mg·kg-1。隨著氮素施用水平的升高，不同器官的P含量均呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），N1處理的P含量均高于其他處理。葉片和莖的K含量分別為5 972.60~10 864.15 mg·kg-1和5 212.78~7 170.78 mg·kg-1，且呈現(xiàn)出與P含量類似的變化規(guī)律；而根中K含量隨氮素施用水平的增加而提高，N1、N2和N3處理根中K含量顯著低于N4和N5處理（P＜0.05）。此外，根、莖、葉中Ca、Mg、Cu、Fe含量基本呈現(xiàn)為低水平氮抑制、高水平氮促進(jìn)的變化趨勢(shì)。根、莖、葉中Ca含量為1 084.78~7 130.86 mg·kg-1，平均2 828.44 mg·kg-1；Mg含量為596.16~1 347.41 mg·kg-1，平均915.73 mg·kg-1；積累量最低的Cu含量為34.05~85.51 mg·kg-1，平均57.56 mg·kg-1；根、莖、葉中Fe含量為318.32~708.15 mg·kg-1，平均492.86 mg·kg-1。

圖1 不同氮素水平下雪菊各器官的P、K、Ca、Mg、Cu和Fe含量Fig.1 Contents of P，K，Ca，Mg，Cu and Fe in different organs of Coreopsistinctoria under different treatments

2.3 不同氮素處理對(duì)雪菊幼苗株高和總生物量的影響

對(duì)不同處理各器官的生物量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明，N4處理的根干質(zhì)量顯著高于其他處理；N3和N4處理的莖干質(zhì)量顯著高于N1和N5處理；N2、N3和N4處理的葉干質(zhì)量顯著高于N1和N5處理；N3和N4處理的植株總干質(zhì)量顯著高于N1和N5處理。隨著氮素施用水平的升高，株高呈先升后降的趨勢(shì)，N4處理株高最高，為20.95 cm；N5處理的株高最低，為17.67 cm，較N4處理減少15.85%。

圖2 不同氮素水平下雪菊的干質(zhì)量和株高Fig.2 Dry weight and plant height of Coreopsistinctoria under different treatments

2.4 不同氮素處理對(duì)雪菊幼苗類黃酮含量的影響

由表2可知，在不同氮素水平下，莖和根中總黃酮積累量相對(duì)穩(wěn)定，變幅分別為2.72~2.90和5.52~5.84 mg·g-1；而葉中總黃酮類積累量則表現(xiàn)出不同的變化，即低、中氮水平(N1、N2和N3處理)的總黃酮積累量較高，高氮水平（N4和N5處理）總黃酮積累量較低，其中，N3處理葉片總黃酮含量為16.23 mg·g-1，較N5處理增加26.6%。分別對(duì)木犀草素、槲皮素和蘆丁在不同器官中的積累量進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，蘆丁的平均積累量較高，為1.32 mg·g-1，其次是木犀草素（0.24 mg·g-1），槲皮素含量較低，為0.16 mg·g-1。不同器官進(jìn)行比較，葉中黃酮類物質(zhì)積累量較高，而根中較低。

表2 不同氮素水平下雪菊各器官類中黃酮物質(zhì)含量Table 2 Contents of flavonoids in different organsof Coreopsistinctoria under different treatments

由表3可知，木犀草素積累量和P含量呈顯著正相關(guān)；K含量與黃酮類物質(zhì)積累量呈顯著正相關(guān)；Ca、Fe、Cu含量均與黃酮類物質(zhì)積累量呈顯著負(fù)相關(guān)；Mg含量和木犀草素積累量呈顯著負(fù)相關(guān)。

表3 黃酮類化合物含量與礦質(zhì)元素的相關(guān)性分析Table 3 Correlations between flavonoids content and mineral element

2.5 不同氮素處理對(duì)雪菊幼苗黃酮類物質(zhì)代謝關(guān)鍵酶活性的影響

氮素水平對(duì)不同器官黃酮類化合物的關(guān)鍵酶活性有顯著影響（圖3）。在低、中氮水平（N1、N2和N3處理）下，葉中PAL、C4H、4CL和CHS的活性較高，顯著高于高氮水平（N4和N5處理）。N4處理中F3H和FLS活性較高，顯著高于低、中氮水平（N1、N2和N3處理）。根和莖中C4H、4CL、CHS和F3H在N4和N5處理中的活性顯著高于其他處理；而PAL在N3處理中的活性顯著高于其他處理，F(xiàn)LS在N4處理中的活性顯著高于其他處理。

圖3 不同氮素水平下雪菊各器官中類黃酮關(guān)鍵酶的活性Fig.3 Activities of key enzymes on flavonoids in different organs of Coreopsistinctoria under different treatments

3 討論

3.1 氮素水平對(duì)黃酮類物質(zhì)積累的影響

近年來，天然抗氧化劑，特別是來自于植物中的黃酮類化合物，因其在治療退行性疾病中的獨(dú)特療效引起人們的廣泛關(guān)注。黃酮類化合物的積累易受環(huán)境因素影響，如溫度[15]、光照[16]和礦質(zhì)元素[17]等。雪菊是新疆地區(qū)廣泛栽培的藥用植物，且被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。然而，關(guān)于氮素水平對(duì)雪菊黃酮類化合物積累量和產(chǎn)量影響的研究十分有限。本研究表明，隨著氮素施用水平的增加，雪菊莖和根中黃酮類化合物積累量未發(fā)生顯著性變化，但在低、中氮水平下，葉中黃酮類化合物積累量顯著高于高氮水平，此研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了高氮水平會(huì)抑制植物黃酮類物質(zhì)的積累[18]。

碳和氮代謝是涉及植物次生代謝的基礎(chǔ)代謝。與青錢柳[19]、甘藍(lán)[20]、煙草[21]等植物的研究結(jié)果一致，施用氮肥同樣使雪菊的碳氮平衡發(fā)生改變。植物內(nèi)部碳/氮平衡的改變會(huì)進(jìn)一步影響植物的生長發(fā)育，包括參與氮同化的相關(guān)基因的表達(dá)以及次生代謝物質(zhì)的生物合成等。研究發(fā)現(xiàn)，氮素缺乏會(huì)影響植物生長和防御之間的碳分配[19]。當(dāng)植物的生長量下降時(shí)，植物中用于防御的化合物（如類黃酮）會(huì)得到大量積累。在煙草中，氮消耗可以增加其葉片中氨基酸和碳水化合物含量，并進(jìn)一步抑制光合作用。由此可見，氮在初級(jí)代謝和次級(jí)代謝中發(fā)揮重要作用，通過改變植物所需的碳資源，進(jìn)而影響碳氮平衡，而這種平衡的改變具體表現(xiàn)在氮同化[11]、代謝物積累[22]及形態(tài)發(fā)育[10]等方面。本研究中,不同氮素水平下雪菊黃酮類物質(zhì)積累量和產(chǎn)量的變化趨勢(shì)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。葉中總黃酮、木犀草素、槲皮素和蘆丁的產(chǎn)量分別為46.41~62.32、0.64~0.89、0.57~0.96和5.28~6.69 mg·g-1；葉中總黃酮和3種單體類黃酮物質(zhì)的產(chǎn)量均以低、中氮水平時(shí)較高，而高氮水平時(shí)產(chǎn)量較低；單株黃酮類物質(zhì)積累的變化趨勢(shì)與葉中變化規(guī)律一致，與產(chǎn)量最低的N5處理相比，總黃酮、木犀草素、槲皮素和蘆丁的平均產(chǎn)量分別增加了34.3%、39.4%、68.5%和26.8%；且與幼苗株高狀態(tài)相對(duì)應(yīng)，即氮素含量過高會(huì)抑制植株的生長。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了生長分化假說，即當(dāng)植物處于營養(yǎng)缺乏的環(huán)境時(shí)，其生長受到營養(yǎng)的限制，光合作用較低，更多的同化物會(huì)優(yōu)先供應(yīng)給次生代謝，而不是生長；相反，在高氮素水平下，更多同化物會(huì)優(yōu)先分配給生長，而不是分化[23]。

不同器官中黃酮類物質(zhì)的積累存在差異。雪菊根和莖中黃酮類物質(zhì)的積累受氮素水平影響較小；而葉中黃酮類物質(zhì)在低、中氮水平下積累量較多。可能是由于葉片是植物主要的光合器官，因此，也是黃酮類物質(zhì)合成的主要部位，它們能夠通過維管束組織從合成部位長距離運(yùn)輸?shù)竭h(yuǎn)距組織（根尖）[24-25]。

植物在響應(yīng)環(huán)境脅迫后，黃酮類物質(zhì)的積累受苯丙烷代謝途徑的調(diào)控，包括營養(yǎng)脅迫、光照脅迫和真菌感染等[26]，因此，不同氮素處理會(huì)影響雪菊黃酮類物質(zhì)生物合成中關(guān)鍵酶的活性。Liu等[9]研究表明，高氮素水平會(huì)抑制菊花葉片PAL活性，并抑制黃酮類化合物的積累。本研究也表明，低、中氮水平下PAL活性顯著高于高氮水平；且C4H、4CL和CHS均在低、中氮水平下活性較高，與黃酮類物質(zhì)的變化趨勢(shì)相一致。由此說明，位于黃酮類化合物合成途徑上游的基因可能對(duì)黃酮類物質(zhì)積累起主要調(diào)控作用。此外，研究表明，黃酮類物質(zhì)含量的增加通常伴隨著碳水化合物的累積[27]，可能是編碼PAL、C4H、4CL和CHS的基因受碳水化合物調(diào)控，最終促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)的積累，與生菜中的研究結(jié)果相似[28]。氮素對(duì)雪菊碳氮平衡和黃酮類化合物的積累起一定的調(diào)控作用，但其調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 氮素水平對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)平衡的影響

礦質(zhì)元素是植物生長不可或缺的重要成分，例如，缺P或K會(huì)影響植物光合作用[29-30]，高Cu不利于酚類化合物的積累[31]。本研究表明，氮素對(duì)雪菊幼苗的礦質(zhì)元素含量影響顯著。在植物生長發(fā)育過程中，不同礦質(zhì)元素間存在協(xié)同或拮抗作用，其中，N的積累會(huì)抑制P或K的吸收。研究發(fā)現(xiàn)，缺P可激活黃酮類生物合成基因的表達(dá)[32]；且在缺P條件下，煙草中黃酮醇積累量增加[33]。本研究表明，雪菊中木犀草素積累量和P含量呈顯著正相關(guān)，說明N和P間的相互作用對(duì)雪菊中黃酮類物質(zhì)的積累有一定影響。Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高K有利于促進(jìn)菊花葉片中黃酮類化合物的積累，與本研究結(jié)果一致。缺K使葉片中碳水化合物（蔗糖）的轉(zhuǎn)運(yùn)受到限制，導(dǎo)致葉片中可溶性糖大量累積；而植物體內(nèi)碳水化合物富余時(shí)，有利于將更多的能量用于黃酮類物質(zhì)的合成[34]。綜上所述，雪菊黃酮類物質(zhì)的積累受氮水平以及植物內(nèi)部礦質(zhì)營養(yǎng)平衡的影響，較低的氮水平有利于雪菊葉片中黃酮類物質(zhì)的積累。