不同方法提取沙苑子粗蛋白及DPPH自由基清除活性研究

樊輕亞，汪學猛

（信陽職業(yè)技術學院，河南 信陽 464000）

沙苑子為豆科一年生草本植物扁莖黃芪的成熟種子，內含蛋白質、多肽，黃酮類、鞣質、維生素A類物質等化學成分。研究表明，其具有抗衰老、抗腫瘤、調脂和保肝等作用[1-6]。此外，沙苑子也有明顯的體外抗氧化活性。相對藥材黃芪來說，沙苑子的研究尚處起步階段，隨著黃芪種植面積的加大，沙苑子的產量也隨之增加，多余資源的開發(fā)問題將提上日程。

自由基學說認為，自由基攻擊生命大分子造成組織細胞損傷，是引起機體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。因此有效的自由基清除劑一直是近年的研究熱點。植物中含有眾多消除活性氧自由基的抗氧化類功能因子，從植物中尋找高效、廉價、低毒的天然抗氧化劑成為目前發(fā)展的一個必然趨勢[7-10]。本文旨在探索從沙苑子中提取蛋白質的最佳條件，并對其體外內抗氧化能力方面的藥用價值進行研究，為其在功能食品、保健食品、化妝品和藥品等方面的應用提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Cary 50 紫外分光光度計（美國Varian公司）；RE-5205型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；LGJ-10B型冷凍干燥機（北京四環(huán)科學儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）；KDC-1044低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH，F(xiàn)luka公司）；抗壞血酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸、氫氧化鈉、石油醚、無水乙醇均為分析純。沙苑子，安徽亳州藥材市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質自提取實驗

1）材料預處理。取材料沙苑子粉碎，過2號篩，粉末用濾紙包好置入索氏提取器中用石油醚（30~60 ℃）浸泡1夜，次日，于水浴鍋在46 ℃回流提取，提取時間24 h，最大量的除去油脂，提取液回收石油醚及油，渣晾干，備用。

2）蛋白質提取方法。采用堿提酸沉法從沙苑子中提取分離蛋白質。工藝流程：籽料→除雜→粉碎→過篩→堿液提取→離心→上清液調酸→過濾→沉淀干燥→成品。

3）常溫磁力攪拌法。稱取10 g渣料，加入一定比例的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為10～11，常溫磁力攪拌1 h，低速離心4 000 r·min-1離心10 min，殘渣重新提取，合并兩次上清液。

4）加熱磁力攪拌法。稱取10 g渣料，加入一定比例的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為10～11，50 ℃條件下磁力攪拌1 h，離心取沉淀，殘渣重新提取，合并兩次上清液。

5）常溫超聲提取法。稱取10 g渣料，加入一定比例的蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為10～11，超聲提取1 h，低速離心10 min，殘渣重新提取，合并兩次上清液。

6）加熱超聲提取法 稱取10 g渣料，加入一定比例蒸餾水，攪拌均勻，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為10～11，50 ℃超聲提取1 h，離心取沉淀，殘渣重新提取，合并兩次上清液。

7）將上述常溫磁力攪拌、加熱磁力攪拌、常溫超聲提取、加熱超聲提取的上清液，分別加1 mol·L-1鹽酸調節(jié)pH值至2～3，放冰箱靜置1夜。離心取沉淀，用1 mol·L-1NaOH溶液調節(jié)pH值為中性，冷凍干燥24 h、稱重，得棕色沙苑子蛋白質。

1.2.2 粗蛋白得率計算方法

式中：m1—干燥后蛋白質質量；

m2—提取前原料質量。

1.2.3 抗氧化實驗[11-13]

1）溶液配制。稱取0.039 4 g DPPH, 用無水乙醇配制成濃度為0.001 mol·L-1DPPH溶液。

稱取0.005 g蛋白質提取物，用無水乙醇定容配制成質量濃度分別為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1樣品溶液。

稱取0.005 g抗壞血酸，用無水乙醇定容配制成質量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1抗壞血酸溶液，避光保存。

2） 清除DPPH自由基 以抗壞血酸作為陽性對照，根據(jù)呈深紫色的DPPH 甲醇溶液，在最大吸收峰 517 nm 處褪色程度測定沙苑子蛋白質的DPPH 清除能力。

DPPH自由基清除率計算式：

式中：At—樣品和DPPH混合液的吸光度；

A0—溶劑和DPPH混合液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對沙苑子蛋白得率和蛋白純度的影響

由圖1（a）可見，不同的提取方式對于沙苑子的蛋白質得率有影響，磁力攪拌隨著溫度的提高，得率有所增加；而超聲提取時，隨著溫度的提高，蛋白質反而下降。

圖1 不同提取方法對沙苑子的蛋白得率（a）和蛋白質純度（b）的影響

由圖1（b）可見，不同的提取方式對于沙苑子的蛋白質純度影響頗大，在常溫磁力攪拌條件下，蛋白質純度較高，達78%；伴隨溫度的提高，純度有所下降；而超聲提取時，伴隨溫度的提高，蛋白質純度下降。總體磁力攪拌所得蛋白質純度均高于超聲提取法所得蛋白質；溫度提高，可能影響到蛋白質的穩(wěn)定性，故純度均降低。

綜圖1所示，沙苑子粗蛋白的得率與純度與提取溫度有直接關系，超過30 ℃，蛋白質純度降低，故提取時盡量保持常溫；冷藏和冷凍時也需控制溫度，否則蛋白質變性影響后期實驗的結果。

2.2 不同提取方法對主要氨基酸的影響

由圖2可見，不同方法得到的粗蛋白中必需氨基酸有不同程度變化，隨溫度升高，提取率有所增加，其中磁力攪拌法提取氨基酸的效率高于超聲提取。

圖2 不同提取方法得到的粗蛋白中必需氨基酸含量（g·100 g-1）

但對比黑豆、黃豆的營養(yǎng)成分，沙苑子中的甲硫氨酸含量很高，對養(yǎng)殖方面是一種優(yōu)秀的資源，值得開發(fā)。

2.3 DPPH自由基的清除作用

抗壞血酸質量濃度和蛋白質提取物質量濃度對DPPH自由基清除率的影響見圖3。

由圖3（a）可見，DPPH自由基清除率隨抗壞血酸濃度的增加而增加。由圖3（b）可見，沙苑子蛋白質對DPPH自由基的清除率隨提取物質量濃度的增加而增加，表明沙苑子粗蛋白有明顯的清除作用，在其質量濃度為 0.1 g·L-1時，清除率高達50.64%，表明沙苑子粗蛋白可作為抗氧化藥物和保健品的資源。

圖3 抗壞血酸質量濃度（a）和沙苑子蛋白質量濃度（b）對DPPH自由基清除率的影響

3 結 論

本文用堿提酸沉法輔助不同的提取方式，考察蛋白質最佳提取方案，為沙苑子蛋白質開發(fā)打下良好的基礎。本文研究表明，沙苑子清除自由基的能力與其蛋白含量有關，據(jù)此推斷沙苑子改善血液流變學指標、抗衰老、降脂保肝、抑制血小板聚集、增強免疫功能等作用也可能與其抗氧化活性和蛋白質含量有關。后繼可進一步開發(fā)沙苑子的有效成分，揭示沙苑子的藥理作用機制，促進沙苑子資源的開發(fā)利用。