黏質沙雷氏菌產舍雷肽酶的發酵培養基優化

梅建鳳,鄭素晶,陳 翔,李 靚,易 喻,應國清

(1.浙江工業大學 藥學院,浙江 杭州 310014;2.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院,浙江 舟山 316021)

舍雷肽酶,又稱沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等,英文名稱有serrapeptase,serratiopeptidase,serralysin和serratia-protease等。它是一種堿性金屬蛋白酶,最初是從黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)E15菌株中分離得到,因其來源而得名[1-3]。舍雷肽酶具有出色的酪蛋白水解和溶纖活性,能水解組織中異常滲出物、變性蛋白質和血纖維凝塊,使膿、痰和血凝塊等液化而易于排出,具有良好的抗炎、抗菌、消腫和化痰作用[4-6],舍雷肽酶無論是單獨使用,還是與其他藥物聯合使用,對動脈粥樣硬化、淀粉樣變性、牙周炎、支氣管炎、鼻竇炎、類風濕性關節炎、腕管綜合征和其他各種自身免疫性疾病都有較好的治療效果[7-11],該酶還能促進抗生素在組織中滲透,從而增強抗生素的治療效果[12]。早在20世紀60年代,舍雷肽酶就在日本上市,隨后在世界多個國家上市并使用至今。因出色的功效和無副作用的特性,近年來,該酶作為輔助治療藥物和抗心血管疾病的保健食品市場需求旺盛,在電商平臺上的銷售量逐年增長。

目前,國際市場上的舍雷肽酶主要由日本和印度生產,國內未見有企業生產。為了開發具有自主知識產權的舍雷肽酶生產工藝,梅建鳳等[13-14]開展了舍雷肽酶產生菌的分離、誘變育種、酶學性質和發酵工藝等研究,從家蠶(BombyxmoriL.)的蠶蛹腸道中分離得到一株黏質沙雷氏菌LL-413,能產生分子質量為52 kDa的舍雷肽酶。有關菌株的分離、鑒定和酶學性質研究已在文獻[14]中報道,筆者研究報道該菌株產舍雷肽酶發酵培養基優化,首先在初始牛肉膏蛋白胨培養基的基礎上,通過單因素設計法[15]確定發酵培養基中的主要成分;然后采用響應面分析法[16-17]確定主要成分的較佳濃度;最后考察了培養基初始pH和培養時間對產酶活力的影響,確定了黏質沙雷氏菌LL-413產舍雷肽酶的較佳培養基組成和培養時間,黏質沙雷氏菌LL-413的發酵產酶活力得以大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 菌種和主要試劑

黏質沙雷氏(S.marcescens)LL-413菌株,分離自家蠶的蠶蛹腸道,保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號CCTCC M2015780;福林酚試劑(生物試劑),國藥集團化學試劑有限公司;實驗所用其他試劑均為市售分析純試劑或生物試劑。

1.2 儀器和設備

GI54DWS型壓力蒸汽滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;SHP-250D生化培養箱,上海森信實驗儀器有限公司;HZ-9311K恒溫振蕩培養箱,太倉華利達實驗設備有限公司;SW-CJ-2D型超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;SP-752型紫外-可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

種子培養基和初始產酶培養基均為牛肉膏蛋白胨培養基,成分包括:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.0。250 mL三角瓶裝50 mL培養基,8層紗布扎口,121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 初始產酶培養

0.5 mL的20%甘油冷凍保藏菌液接入20 mL的種子培養基,于30 ℃、200 r/min搖床中培養12 h后獲得種子液,按1%的體積分數移取種子液接種于產酶培養基,于30 ℃、200 r/min搖床中培養24 h。

1.3.3 酶活的測定

培養液經5 000 r/min離心10 min后取上清液,經過適當倍數稀釋后測定酶活。1 mL待測酶液和1 mL酪蛋白水溶液(20 g/L,50 mmol/L,pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制)于試管中,振蕩混合后于37 ℃水浴中保溫10 min,再加入2 mL的三氯乙酸終止液(TCA,0.4 mol/L)終止酶解反應,繼續水浴保溫20 min,經8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液于另一試管中,加入5 mL的Na2CO3(0.4 mol/L)和1 mL福林酚試劑,37 ℃水浴保溫顯色30 min,以酶解反應保溫前加入TCA的相同處理為參比,測定A660,依據相同實驗方法繪制的酪氨酸濃度—A660標準曲線,計算出酶解體系中酪氨酸的質量(μg),舍雷肽酶活力的定義:在pH 8.0、37 ℃反應條件下,1 min水解10 g/L酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位U。按上述定義計算發酵液中舍雷肽酶的活力。

1.3.4 菌體生物量的測定

培養液用去離子水稀釋10倍后,以稀釋相同倍數未接種的培養基為參比,測定OD600,依據預先制作的菌體OD600—菌體干質量標準曲線,計算培養液中的菌體干質量得率(g/L)。

1.3.5 實驗設計

首先,采用單因素實驗優化培養基的碳源的種類及濃度、氮源的種類及濃度和無機鹽種類;然后,以單因素實驗為基礎,采用Box-Benhnken實驗設計對黏質沙雷氏菌產舍雷肽酶的產酶條件進行3因素3水平的響應面分析,確定麥芽浸粉、酵母浸粉和牛肉膏的較優濃度;最后,考察培養基初始pH和培養時間對產酶活力的影響。

所有實驗均重復3次,實驗數據以3次實驗結果的平均值表示。Box-Behnken實驗采用Design-Expert V12設計和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗優化結果與分析

2.1.1 碳源種類及濃度對產酶活力的影響

因為初始產酶培養的牛肉膏蛋白胨培養基中無糖類碳源,添加糖類碳源有利于菌體大量生長和產酶,所以在牛肉膏蛋白胨培養基的基礎上,分別添加10 g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、麥芽浸粉和乳糖作為碳源,不同碳源對產酶活力的影響如圖1所示。由圖1可知:在牛肉膏蛋白胨培養基中添加10 g/L麥芽浸粉時,菌體干質量得率和酶活顯著高于其他碳源,達到301.8 U/mL。

圖1 不同碳源對產舍雷肽酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon sources on the production of serrapeptase

麥芽浸粉不僅含有糖類,還含有>4%的蛋白質和氨基酸,有利于細菌的生長,因此麥芽浸粉是黏質沙雷氏菌產舍雷肽酶的合適碳源,進而考察其質量濃度(4～14 g/L)對酶活的影響,結果如圖2所示。由圖2可知:當麥芽浸粉質量濃度低于10 g/L時,酶活隨其濃度的增加而增加;當其達到12 g/L以上時,酶活則開始有所下降,因此合適的麥芽浸粉質量濃度為10 g/L。

圖2 麥芽浸粉質量濃度對產舍雷肽酶活力的影響Fig.2 Effect of malt extract concentration on the production of serrapeptase

2.1.2 氮源種類及濃度對產酶活力的影響

以10 g/L的麥芽浸粉作為培養基的碳源,考察不同氮源對產酶活力的影響。培養基中分別添加10 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、脫脂奶粉,以及5 g/L牛肉膏+5 g/L酵母浸粉(簡稱牛+醇)、5 g/L牛肉膏+5 g/L蛋白胨(簡稱牛+蛋),不同氮源對產酶活力的影響如圖3所示。由圖3可知:當以5 g/L牛肉膏+5 g/L酵母浸粉作為氮源時,雖然菌體干質量得率低于脫脂奶粉為氮源,但酶活顯著高于其他種類的氮源,此時酶活為360.2 U/mL。進一步分別考察牛肉膏和酵母浸粉質量濃度對產酶活力的影響。

圖3 不同氮源對產舍雷肽酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on the production of serrapeptase

保持酵母浸粉的質量濃度5 g/L不變,考察牛肉膏質量濃度(2～14 g/L)對產酶活力的影響,結果如圖4所示。由圖4可知:提高產酶培養基中牛肉膏質量濃度,產酶活力并沒有提高,而當其質量濃度高于5 g/L時,酶活反而有所降低。

圖4 牛肉膏質量濃度對產舍雷肽酶活力的影響Fig.4 Effect of beef extract concentration on the production of serrapeptase

保持牛肉膏質量濃度5 g/L不變,考察酵母浸粉質量濃度(2.5～15 g/L)對產酶活力的影響,結果如圖5所示。由圖5可知:當酵母浸粉質量濃度低于10 g/L時,酶活隨其質量濃度增加而增加,之后酶活開始有所下降。因此合適的酵母浸粉質量濃度為10 g/L,此時,酶活為392.0 U/mL。

2.1.3 無機鹽種類對產舍雷肽酶的影響

無機鹽是微生物生長以及合成代謝產物不可缺少的營養成分,選取微生物培養基常用的無機鹽ZnSO4(1 g/L)、MgSO4(1 g/L)、MnSO4(1 g/L)、KH2PO4(5 g/L)和K2HPO4(5 g/L),分別添加到培養基中,它們對產酶活力的影響如圖6所示。由圖6可知:當產酶培養基中加入1 g/L的ZnSO4、1 g/L的MgSO4和5 g/L的K2HPO4時,菌體干質量得率和產酶活力均有提高。培養基中同時添加這3種無機鹽的實驗結果表明酶活達到564.7 U/mL。

2.2 響應面實驗優化結果與分析

2.2.1 設計方案和實驗結果

由單因素實驗結果可知:麥芽浸粉、酵母浸粉與牛肉膏的質量濃度對舍雷肽酶的酶活Y的影響較大。微生物培養基中的碳源和氮源往往存在交互作用,因此采用Box-Behnken中心組合設計的響應面實驗優化它們的質量濃度,因素水平以及編碼設計如表1所示,實驗結果如表2所示。

表1 Box-Behnken實驗設計的因素和水平及編碼Table 1 Factors and levels for Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken實驗設計結果Table 2 Results of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應面模型及顯著性分析

運用Design-Expert V12對表2中的實驗結果進行二次多項式回歸擬合,得到以編碼因素表示的回歸模型方程:Y=568.8+48.0A+15.4B+43.6C+4.05AB+7.95AC+26.4BC-71.3A2-62.4B2-45.9C2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variances of the regression model

由Design-Expert V12軟件得到的麥芽浸粉質量濃度、酵母浸粉質量濃度和牛肉膏質量濃度3個因素之間的模型響應面圖如圖7所示。由圖7可以直觀地看出各因素對酶活影響的變化趨勢,其中麥芽浸粉質量濃度對酶活的影響較大,隨著其質量濃度的增加,酶活先有提高后降低,其次是牛肉膏濃度,雖然酵母浸粉質量濃度對酶活的影響相對較小,但是也達到了顯著水平(P<0.05)。

圖7 各因素交互作用對產舍雷肽酶活力影響的響應面圖Fig.7 Response surfaces showing the effects of factors on the production of serrapeptase

2.2.3 優化結果驗證

依據Design-Expert V12給出的最佳產酶條件:A=0.38,B=0.26,C=0.58,即麥芽浸粉質量濃度為11.9 g/L,酵母浸粉質量濃度為11.3 g/L,牛肉膏質量濃度為6.45 g/L,酶活最大預測值為592.5 U/mL。依據上述優化值做驗證實驗,3次實驗的平均值為596.4 U/mL,與最大預測值基本相符,說明該模型有較高的準確性和實用性。經響應面分析實驗優化,黏質沙雷氏菌LL-413發酵產酶活力從564.7 U/mL增加到596.4 U/mL,提高了5.67%。

2.3 培養基初始pH對產舍雷肽酶的影響

合適的培養基初始pH有利于菌體生長及產酶活力的提高,在確定培養基成分后,考察培養基初始pH對產酶活力的影響,結果如圖8所示。由圖8可知:當培養基初始pH低于8.0時,隨著pH增加,酶活也隨之增加；當培養基初始pH為8.0時,舍雷肽酶活力最高,這說明因舍雷肽酶屬于堿性蛋白酶,偏堿性的培養環境有利于產酶活力的提高。

圖8 培養基初始pH對產舍雷肽酶活力的影響Fig.8 Effect of the medium initial pH on the production of serrapeptase

2.4 產酶培養的時間曲線

初始產酶培養時間為24 h,經過培養基組成優化后,營養成分的質量濃度都有提高,24 h的培養時間可能不足,為此考察培養時間對產酶活力的影響,產酶培養的時間曲線如圖9所示。由圖9可知:產酶培養基接種后,菌體很快進入對數生長期;28 h后,雖然菌體生長達到平穩期,但是酶活還在繼續增加;36 h時達到最大值,此時酶活為1 121 U/mL,菌體干質量得率為5.33 g/L。綜上,合適的產酶培養時間為36 h。

圖9 培養時間對產舍雷肽酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the production of serrapeptase

3 結 論

通過單因素實驗,發現麥芽浸粉、酵母浸粉與牛肉膏的質量濃度對舍雷肽酶的酶活的影響較大,因此采用Box-Behnken中心組合設計和Design-Expert V12軟件對麥芽浸粉、酵母浸粉與牛肉膏的質量濃度進行優化,得到優選產酶培養基組成,在此基礎上考察培養基初始pH和培養時間對產酶活力的影響,最終得到較優培養條件:麥芽浸粉11.9 g/L,酵母浸粉11.3 g/L,牛肉膏6.45 g/L,MnSO41 g/L,ZnSO41 g/L,K2HPO45 g/L,NaCl 5 g/L,初始pH 8.0,溫度30 ℃,振蕩轉速200 r/min,接種量1%,培養時間36 h。在此條件下,黏質沙雷氏菌產舍雷肽酶活力達到1 121 U/mL,較優化前提高了3.89倍。筆者的研究結果為黏質沙雷氏菌產舍雷肽酶的工業化應用提供了參考。