馬尾松和紅錐葉片解剖和光合對穿透雨減少的響應

郭鑫煒，劉世榮＊，王 暉，陳志成，聶秀青，張京磊,2，明安剛，陳 琳

(1.國家林業和草原局森林生態環境重點實驗室，中國林業科學研究院森林生態環境與自然保護研究所，北京 100091；2.農業農村部華東都市農業重點實驗室，山東省農業科學院休閑農業研究所，山東 濟南 250100；3.中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心，廣西 憑祥 532600)

大量的監測數據和全球氣候變化模型表明降雨時空格局正在發生改變，由此引起的干旱頻度、強度以及持續時間的增加將會成為許多地區面臨的問題[1]，尤其是在亞熱帶地區[2-3]。干旱的增加將會對森林生態系統的群落多樣性、生存以及生產力產生巨大影響[4]，進而可能影響局域或全球的碳水平衡。

葉片對環境變化較為敏感且可塑性較大，其性狀特征與植物生存策略和利用資源的能力密切相關[5-6]。因此，加強葉片性狀的研究有助于更好地了解植物對干旱的響應與適應。目前，國內外學者從葉片形態、解剖以及生理等性狀探究了植物對干旱的響應與適應[7-11]。然而，這些研究大多數是短期的控制實驗且缺乏對于葉片解剖結構和光合生理同步研究。因此，對于葉片解剖結構和光合生理對于相對長期干旱脅迫的適應以及二者之間關系的了解依然不足。

研究降雨減少對于葉片解剖結構和光合生理的影響有助于揭示樹木對于干旱的適應機制[11]。不同樹種對于干旱的敏感性和響應時間存在差異，其葉片解剖結構和光合生理對干旱的響應和適應可能存在物種特異性[11]。對不同水分脅迫條件下地中海2種觀賞灌木（馬纓丹（Lantana camaraL.）和女貞（Ligustrum lucidumW.T.））的研究發現：2種灌木葉片厚度對于水分脅迫響應存在明顯差異并指出葉片光合能力與水分脅迫的強度有關[8]。Gratani等[12]發現，干旱條件下葉片厚度的增加可以減少蒸騰失水，維持細胞內較高的水勢，從而保證正常的光合速率，提高植物的水分利用效率。然而，Binks等[13]和Rowland等[14]對模擬干旱條件下熱帶雨林樹種的研究證實，葉片解剖結構對于干旱的響應與物種的抗旱性有關，且發現由干旱引起的葉片解剖結構改變未對光合性狀產生影響[13]。因此，到目前為止，葉片解剖結構和光合生理對降雨減少的響應認知仍然存在很大爭議，這使得理解樹木生長對于氣候變化的響應具有較大的不確定性。

馬尾松（Pinus massonianaLamb.）和紅錐（Castanopsis hystrixMiq.）是我國亞熱帶地區的典型造林樹種。馬尾松具有適應性強、生長迅速、生產力高等特點[15]，紅錐材質優良，具有多種用途[16]。紅錐和馬尾松的葉片習性、木材解剖和水力學性狀存在明顯差異，導致2樹種擁有不同的生活史特征和環境需求[17-18]，這為探究具有不同生活史特征的物種對于干旱的響應和適應提供了絕佳的機會。前人研究已經認識到馬尾松和紅錐人工林生長對于干旱的響應存在差異，穿透雨減少后馬尾松徑向生長未發生變化而紅錐徑向生長出現顯著下降[19]。然而，馬尾松和紅錐葉片解剖結構和光合生理如何響應干旱目前尚未可知。為了進一步探究葉片解剖結構、養分和光合生理對于干旱的響應，解析三者之間的關系，本研究在南亞熱帶選取馬尾松和紅錐人工純林設置穿透雨減少實驗，測定了2種樹木葉片解剖結構、葉片養分（氮和磷）、氣體交換參數和葉綠素熒光參數，旨在探索以下科學問題：（1）馬尾松和紅錐葉片解剖、葉片養分以及光合生理如何響應干旱？減雨處理后樹木是否能夠產生更耐旱的葉片？（2）葉片解剖和葉片養分是否能夠影響葉片的光合生理？

1 材料與方法

1.1 研究地點

研究地點位于廣西壯族自治區憑祥市中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心伏波實驗場（22°10′N,106°50′ E），該地區位于南亞熱帶季風氣候區，屬濕潤-半濕潤氣候，干濕季分明。年降水量1 241～1 695 mm，降雨主要集中在5—9月，年平均溫度21～22 ℃，相對濕度80%～84%，海拔550 m。主要的地貌類型以低山丘陵為主，土壤為紅壤，質地為砂質壤土。

馬尾松和紅錐人工林均是1983年皆伐杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）林后種植，最初的土壤質地和養分一致，林分密度均為2500株·hm-2，之后經過多年間伐，馬尾松和紅錐人工林密度分別為275±45、334±92株·hm-2，平均胸徑分別為31.26±2.15、27.15±1.96 cm，平均樹高分別為18.8±1.30、19.84±2.96 m。馬尾松林下草本植物主要有弓果黍（Cyrtococcum patens（L.）A.Camus）、烏毛蕨（Blechnum orientaleL.）、藎草（Arthraxon hispidus（Trin.）Makino）和小花露籽草（Ottochloa nodosavar.micrantha（Balansa）Keng f.）等。紅錐林下草本主要有金毛狗（Cibotium barometz（L.）J.Sm.）、淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）、鐵芒萁（Dicranopteris linearis（Burm.）Underw.）和扇葉鐵線蕨（Adiantum flabellulatumL.）等。

1.2 試驗設計

2012年9月在馬尾松和紅錐人工林中分別設置了6塊20 m×20 m樣地，樣地間距離＞20 m，實施了自然條件下降雨（對照）和部分穿透雨剔除（50%，TFE）2種不同的處理，每個處理3個重復，2個樹種共12塊樣地。在穿透雨剔除樣地距離地面0.5～1.5 m處安裝了由不銹鋼架和PEP膜組成的穿透雨剔除裝置，鋪設的透明塑料薄膜面積為樣地面積的50%。截取的穿透雨通過導水槽及樣地周圍的排水溝排出樣地。為降低TFE裝置對樣地環境的影響，在對照樣地同樣的高度假架設了有不銹鋼架和3 mm孔徑白色尼龍網組成的裝置。經測試，各樣地裝置下照度無顯著差異。定期對PEP膜、尼龍網以及導水槽上的凋落物清理并原位歸還到樣地。與此同時，在每個樣地都安裝HoBo土壤溫濕度記錄儀（Onset Computer Corp.，美國）對5 cm表層土壤和深層土壤（10、30、50、70、90 cm）的溫濕度進行記錄，記錄間隔為1 h，每個樣地各安裝了3個記錄儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 光合特性測定 由于馬尾松和紅錐樹冠較高，難以原位測定，因此，本研究采用高枝剪和人為爬樹剪取離體枝的方法對光合生理參數進行測量。為避免枝條栓塞影響測定結果，所采集測定氣體交換和葉綠素熒光參數的枝條都接近1 m且均為冠層頂部的陽生枝條，將獲取的離體枝條立即插入裝有水的水桶中，在水中用剪枝剪在距離切口10 cm處重新修剪。通過這樣的處理一定程度上避免離體枝條發生栓塞，確保一段時間內離體枝條上葉片樣品的生理活性與樹體一致[20-21]。

氣體交換參數的測定：2019年8月中旬（濕季）和2020年1月中旬（干季）選擇無雨天氣于9：00—11：30時段，采用便攜式光合儀（LI-6400,Li-Cor,Lincoln Inc.,NE,USA）測定了馬尾松和紅錐當年生枝條上完全伸展的健康葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）等參數。設定的光量子通量密度為1500 μmol·m-2·s-1，CO2濃度設置為環境CO2濃度，環境溫度控制在25 ℃。在對照樣地和處理樣地分別隨機選取了3棵樹，每棵樹選取2～3個葉片，每個葉片測定3次重復。利用下列公式計算水分利用效率（WUE）：WUE=Pn/Tr。

葉綠素熒光參數于2019年8月測定。具體方法是先將葉片暗適應30 min用PAM-2500便攜式葉綠素熒光儀（Heinz Walz GmbH，Effeltrich，Germany）測定最小初始熒光（Fo）、暗適應下最大熒光（Fm）、光系統Ⅱ（PSⅡ）最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（ΦPSII）、光化學猝滅系數（qP）、非光化學猝滅系數（NPQ和qN）和表觀電子傳遞速率（ETR）等熒光參數。

1.3.2 葉片解剖 2020年1月在紅錐和馬尾松的對照樣地和穿透雨減少樣地選取與測定氣體交換參數的葉片位置相近、發育一致的健康葉片各5片（馬尾松針葉各5簇），用FAA固定液保存，紅錐剪取葉片中部與葉邊緣之間1～2 cm2，馬尾松剪取中部5～6 mm片段，采用常規石蠟切片法制片。切片厚度為8～12 μm，用番紅-固綠染色，中性樹膠封片。對照樣地和處理樣地分別隨機選取了3片葉子的制片置于Nikon（NIS-Elements D）光學顯微鏡下觀察和拍照記錄，并用儀器自帶分析軟件測量了紅錐葉片上下表皮厚度、葉肉柵欄組織和海綿組織厚度、葉片厚度和馬尾松針葉的上下表皮厚度、葉肉厚度以及針葉厚度。

1.3.3 氣孔密度 采用指甲油印跡法。每個樣地在冠層樹木枝條上隨機選取3片健康完全開展的陽生葉片，紅錐葉片避開主脈用無色指甲油均勻涂抹于葉片中部，馬尾松針葉用指甲油涂抹葉片中部腹面，干燥后剝下所形成的印痕干膜，制片后用Nikon光學顯微鏡觀察和拍照，利用自帶測量軟件獲取氣孔密度。

1.3.4 葉片氮和磷的測定 在測定光合特性指標的枝條上，隨機選取一定量的健康成熟無病蟲害的葉片，放入信封袋中帶回實驗室。將葉片清洗干凈后在600 w的微波爐中殺青90 s，然后再將其放到65 ℃的烘箱中烘干48 h。用高速粉碎機將烘干的葉片粉碎后過100目篩（0.147 mm）備用。葉片全氮（TN）和全磷（TP）分別采用凱氏定氮法和鉬銻抗比色法測定。

1.4 數據分析

用SPSS17.0軟件對數據進行統計分析，采用獨立樣本t檢驗分析處理之間、樹種之間以及季節之間各指標的差異性，以p＜0.05為顯著性評價標準；采用Pearson相關系數分析葉片解剖性狀、葉片養分和氣體交換參數之間的相關關系。本研究中所有的數據均采用平均值±標準誤（Mean±S.E.）的形式表示。用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤溫濕度

土壤溫濕度存在明顯的季節差異，濕季（5—9月）的土壤溫濕度大于干季（10月—次年4月）的土壤溫濕度（p＜0.05）。穿透雨減少處理對馬尾松和紅錐表層（5 cm）土壤溫度無影響（p＞0.05），但降低了2樹種的表層（5 cm）和深層（10、30、50、70、90 cm）土壤濕度（p＜0.05；圖1），其中，穿透雨減少使50 cm土層的土壤濕度下降最大，馬尾松和紅錐分別下降了15.96%和16.76%。

圖1 對照樣地和減雨樣地馬尾松（a、c）和紅錐（b、d）土壤溫度和土壤濕度Fig.1 Soil temperature and soil moisture of Pinus massoniana (a,c) and Castanopsis hystrix (b,d)in the control and the rainfall-reduced plots

2.2 葉片解剖

由圖2得出，馬尾松和紅錐葉片解剖結構明顯不同。馬尾松的葉片橫切面呈半圓形，葉肉不分化柵欄組織和海綿組織，細胞排列不規則但排列緊密，葉肉細胞間存在多個樹脂道。紅錐葉片葉肉存在明顯分化的柵欄組織和海綿組織，細胞排列規則但不緊密，海綿組織發達。穿透雨減少8 a后馬尾松針葉的上、下表皮厚度、內皮層厚度、針葉厚度以及氣孔密度分別顯著增加了28.35%、29.94%、8.46%、8.13%和10.55%，但葉肉厚度未發生顯著改變。對于紅錐來說，穿透雨減少不僅明顯增加了上表皮厚度（24.43%），而且顯著的降低了海綿組織的厚度（23.90%）。穿透雨減少使紅錐葉片柵欄和海綿組織比值增加明顯，但未改變其葉片厚度和氣孔密度（表1）。

表1 馬尾松和紅錐葉片解剖結構Table 1 Leaf anatomical structure of Pinus massoniana and Castanopsis hystrix

圖2 對照樣地和減雨樣地馬尾松（a,b）和紅錐（c,d）葉片解剖Fig.2 Leaf anatomical structure of Pinusmassoniana (a,b) and Castanopsis hystrix (c,d)in the control and the rainfall-reduced plots

2.3 氣體交換和葉綠素熒光參數

由表2得出：馬尾松和紅錐的氣體交換參數存在季節差異和種間差異（p＜0.05）；濕季馬尾松和紅錐的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）顯著高于干季（p＜0.05）；與馬尾松對比，紅錐受到的氣孔限制（Ls）更大，水分利用效率（WUE）更高，尤其是在干季。穿透雨減少對馬尾松和紅錐氣體交換參數和葉綠素熒光參數均無影響（p＞0.05；表2、3和圖3）。

圖3 對照樣地和減雨樣地馬尾松（a）和紅錐（b）葉綠素熒光參數Fig.3 Chlorophyll fluorescence parameters of Pinus massoniana (a) and Castanopsis hystrix (b) in the control and the rainfall-reduced plots

表2 對照樣地和減雨樣地馬尾松和紅錐氣體交換參數Table 2 Gas exchange parameters of Pinus massoniana and Castanopsis hystrix in control and rainfall-reduced plots

2.4 葉片氮、磷含量及氮磷比

由圖4得出：葉片氮、磷含量和氮磷比存在明顯的種間差異。馬尾松的葉片氮含量以及氮磷比顯著低于紅錐的葉片氮含量和氮磷比，而馬尾松的葉片磷含量顯著高于紅錐的磷含量。穿透雨減少處理未對馬尾松和紅錐葉片N、P含量以及N:P產生影響（p＞0.05）。

圖4 對照樣地和減雨樣地馬尾松和紅錐葉片氮（a）、磷（b）含量及葉片N:P（c）Fig.4 Leaf nitrogen content (a),phosphorus content (b) and leaf N:P (c) of Pinus massoniana and Castanopsis hystrix in control and the rainfall-reduced plots

2.5 葉片功能性狀之間的相關關系

由圖5、6得出：馬尾松和紅錐的葉片解剖結構之間、葉片氮和磷之間以及氣體交換參數之間自身存在明顯地相關關系（p＜0.05），但兩樹種的葉片解剖結構、葉片養分與氣體交換參數三種葉片功能性狀之間未發現相關關系（p＞0.05）。

圖5 馬尾松葉片功能性狀之間的相關性Fig.5 The correlation between leaf functional traits of Pinus massoniana

3 討論

3.1 穿透雨減少對葉片解剖的影響

穿透雨減少后馬尾松和紅錐葉片均表現出一定的干旱適應特征，但物種間差異明顯。馬尾松針葉的上、下表皮厚度和氣孔密度在穿透雨減少后顯著增加，而紅錐在穿透雨減少后僅葉片的上表皮厚度出現明顯增加。較厚的表皮能夠使干旱條件下植物葉片維持較高的水勢；氣孔密度的增加有助于提高植物對于蒸騰控制[22-23]，維持正常的生理代謝，從而有助于提高植物的抗旱性。Binks等[13]在對降雨減少條件下的熱帶雨林樹種研究中也發現，降雨減少后葉片下表皮厚度增加明顯，并提出下表皮的增加能夠提高樹種的抗旱性。然而，黃娟等[24]和吳麗君等[25]對干旱脅迫下銀中楊和赤皮青岡研究發現，干旱脅迫使2樹種葉片變薄，下上表皮厚度均出現顯著下降，還認為干旱脅迫造成的葉片水分虧缺導致了葉片細胞生長和分裂受阻，從而導致葉片生長受限。本研究中，馬尾松針葉厚度在穿透雨減少后增加明顯，而紅錐葉片厚度無顯著變化。減雨后馬尾松更厚的葉片往往能夠使其擁有更高的水分儲存能力，從而提高了馬尾松的干旱適應能力[26]。紅錐葉片在減雨后海綿組織厚度出現明顯下降，海綿組織的減少促使葉肉細胞之間變得更為緊密，細胞間隙減小，該特征有助于CO2從氣孔下室到光合作用位點的傳導，抵消因葉肉結構變化和氣孔關閉導致的CO2傳導率的降低[27]，能夠維持正常的光合生理。另外，由于海綿組織所占比例減少使得葉片細胞之間更為緊密，提高了葉片的密度，能夠減少葉片由于失水造成的物理損傷，有助于提高植物的水分利用效率，增強了植物干旱環境下的生存能力[28]。顯然，樹木葉片解剖對于干旱響應是復雜的，這可能歸因于樹種自身屬性和干旱強度的差異[29]。為了探究樹種對于干旱的響應和適應，加強葉片解剖結構的研究是非常必要。

表3 對照樣地和減雨樣地馬尾松和紅錐葉綠素熒光參數Table 3 Chlorophyll fluorescence parameters of Pinus massoniana and Castanopsis hystrix in control and rainfall-reduced plots

3.2 穿透雨減少對光合生理的影響

植物在長期的進化過程中為適應環境變化，不僅在葉片形態和解剖結構上表現出可塑性，同時植物的生理也發生著改變。以往的研究中發現，輕微和中度的水分脅迫會通過減少大氣到葉綠體羧化位點之間CO2的擴散來限制光合作用[30]。然而，在本研究中發現，穿透雨減少后馬尾松和紅錐葉片的光合參數（Pn、Gs、Tr、Ls）以及葉綠素熒光參數（Fv/Fm、ΦPSII、ETR）均未發生變化（p＞0.05）。Fv/Fm是表征光合單元結構健康狀況的指標，穿透雨減少后未發生顯著的改變說明穿透雨減少引起的水分脅迫并未對馬尾松和紅錐葉片的光合系統造成損傷，或經過8 a的穿透雨減少后2樹種已近乎完全地適應了新的干旱環境，從而能夠維持2樹種正常的光合能力。以往的研究表明，干旱脅迫對光合作用的影響主要受葉片水勢控制，輕微的水分脅迫不會影響植物的光合生理，只有當葉片水勢下降到一定閾值后，光合生理才會受到影響[31-32]。在亞熱帶和熱帶開展的類似研究中也發現，葉片的光合作用速率在降雨減少后依然能夠保持穩定，并認為是葉片解剖、水分關系以及光合特性之間緊密的相互協調的結果[13-14,33]。此外，通過對干旱條件下全球C3和C4植物氣體交換參數的整合分析，證明了Gs對于干旱敏感性要高于Pn和Tr，并且發現Gs決定著光合作用速率和蒸騰速率[34-35]。以上研究結論可以用于解釋本研究中處理間馬尾松和紅錐的Pn和Tr無差異的原因，可能是Gs在穿透雨減少后未發生改變。盡管馬尾松和紅錐葉片的光合生理在處理間無顯著差異，但季節變化明顯。與濕季相比，干季紅錐的氣孔限制和水分利用效率明顯更高，說明紅錐更傾向于通過調節氣孔（Ls）來提高植物的水分利用效率（WUE），采取的保守型水分利用策略來適應干旱[36-37]。馬尾松葉片氣孔限制也存在明顯季節差異，但水分利用效率（WUE）在濕季和干季之間幾乎未發生改變，說明干旱條件下馬尾松可能采取的是揮霍型水分利用策略[36-37]。本研究結果證明樹種間光合生理對于干旱的差異響應除了與干旱脅迫強度有關外，也可能與物種所采取的水分利用策略有關。

3.3 葉片解剖結構和光合生理之間的關系

圖6 紅錐葉片功能性狀之間的相關性Fig.6 The correlation between leaf functional traitsof Castanopsis hystrix

結構是葉片功能的基礎，葉片結構的變化往往影響著植物的光合、呼吸以及蒸騰等生理過程。季子敬等[38]對興安落葉松針葉的研究中發現，葉片的最大光合速率和水分利用效率與葉片厚度、內皮層厚度以及傳輸組織厚度存在顯著的正線性關系。在本研究中未發現馬尾松和紅錐解剖性狀與氣體交換參數之間存在顯著關系。產生這種結果的主要原因可能是葉片生長和光合生理對于干旱的響應敏感性差異，造成了葉片解剖結構和光合生理之間解耦。以往的研究證實植物光合作用受到干旱脅迫影響之前植物的生長就已經停止[39]，換言之，干旱條件下植物的光合生理和生長可能不同步[40]。通過對熱帶森林葉片的解剖和光合生理研究證明了改變的葉片解剖結構未對植物的光合能力產生顯著影響[13-14]。對不同土壤條件下，莧菜（Amaranthussp.）葉片的生長、氣孔導度以及蒸騰對土壤干旱的響應研究中同樣證實了葉片生長的土壤水分閾值要高于氣孔導度和蒸騰的土壤水分閾值[31]。在5種多年生木本植物的日蒸騰速率對于土壤干旱的響應研究中，也證實了只有土壤水分下降到一定值時植物的蒸騰速率才會出現明顯下降[41]。最近研究也發現，植物光合能力不能完全通過葉片的解剖性狀來解釋[13-14]，從而推斷出葉片解剖性狀在調控光合作用過程中作用可能不如葉片的生物化學性狀重要[42]。本研究中，葉片的氮含量以及葉片胞間CO2濃度在穿透雨減少后未發生顯著改變在一定程度上支持了這一觀點。穿透雨減少后，胞間CO2濃度未發生顯著改變說明光合作用未受到生物化學限制[43]；同樣葉片氮含量未發生顯著改變也表明了Rubisco含量或活性在處理間可能未發生顯著變化[13,44]，穩定的Rubisco含量或活性保證了葉片的光合能力穩定。因此，葉片解剖結構和光合生理之間關系是復雜多維的受多種因素影響，為了進一步加深干旱條件下葉片光合生理的調控機制的理解，在今后的研究中需對葉片解剖結構和葉片生理化學性狀進行同步監測。

4 結論

馬尾松和紅錐葉片解剖結構對穿透雨的減少表現出了一定的適應性，但物種間差異顯著。穿透雨減少顯著地改變了馬尾松的針葉解剖結構，而對紅錐葉片解剖結構影響有限。馬尾松和紅錐葉片光合生理在穿透雨減少后未發生改變，但存在明顯的季節差異。馬尾松和紅錐氣孔限制（Ls）和水分利用效率（WUE）的季節差異說明了紅錐傾向于采用保守型水分利用策略，而馬尾松采取揮霍型水分利用策略。馬尾松針葉解剖結構在穿透雨減少表現出更明顯的旱生葉片特征，這表明馬尾松對于干旱脅迫的適應是通過調節針葉的解剖結構形成更具耐旱的針葉，而紅錐傾向于調節氣孔導度來適應干旱。另外，本研究中，葉片的光合生理與葉片解剖結構之間無相關性，說明了樹木的光合生理除了受葉片解剖結構影響外也受其它因素影響（如Rubisco含量或活性等）。