橫斷山脈亞高山高山櫟根系可培養真菌的多樣性研究

李鴻博，馬 莉，黃耀華，康定旭，伍建榕，馬煥成＊，陳 詩＊

(1.西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224；2.云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，西南林業大學 生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224)

高山櫟(Quercusspp.)，高山常綠硬葉植物，形態分喬木和灌木型。高山櫟作為橫斷山脈亞高山區域的典型植被和重要生態資源，其垂直分布跨度為900～4800 m，多集中于2400～3600 m之間[1]，水平分布特征為集中型森林分布和離散型散點分布，遍布整個橫斷山脈，作為優勢種與建群種，構成了橫斷山脈亞高山地區特有的森林植被生態系統[2-4]。高山櫟表現出對干旱和寒冷環境的高度適應性，對造林困難地段水土保持和生態恢復具有重要作用[5]。高山櫟作為薪炭林，具極強的萌蘗更新能力，是理想的能源供應物質[6]。

真菌在土壤等自然環境中分布廣泛，許多菌種可侵染植物根系并與其形成互惠共生的菌根。此外，近些年來研究發現暗色有隔真菌（DSE）是植物根系常見的內生菌，部分可與植物根系共生[7]，也有一些屬于植物病原菌，侵染根系后可對植物生理代謝造成嚴重破壞[8]。因此，研究植物根系內生真菌的組成與多樣性對進一步了解宿主植物生態適應性機制，以及篩選對植物生長發育有促進作用的內生真菌具有理論意義和實際應用價值。櫟屬植物根系能夠與部分真菌形成外生菌根（ECM），形成后可提高土壤酶活，并為植物宿主提供水分、氮、磷等營養元素，增強宿主植物對干旱等逆境的抵抗力[9-10]。ECM在與宿主植物形成共生關系的過程中，與土壤中各種病原菌競爭生態位，并最終形成定殖。

我國西部滇、藏地區國家自然資源雖儲備豐富，但高原生態環境脆弱，對其如何保護與治理已成為近年來生態文明建設的重要課題。選擇高山櫟作為研究對象，是因其長期適應高原寒、旱等惡劣生態環境，可以作為高原地區植被恢復的造林備選樹種。楊淑嬌等[11]發現高山櫟林下菌塘同時存在外生菌根（ECMF）和從枝菌根真菌（AMF）。宋富強等[12]對川西亞高山帶森林生態系統外生菌根的研究表明，該地高山櫟0～20 cm與20～40 cm土壤中外生菌根侵染率與海拔高度呈顯著正相關。目前，聚焦于高山櫟根系菌根和益生真菌的研究仍較少。本研究以該地區3種典型高山櫟根系為研究對象，通過對其根系內生真菌分離培養，結合形態學和分子生物學手段鑒定真菌，并對其多樣性進行分析，以明確該地區高山櫟根系內共生真菌的組成和分布區系，為闡明高山櫟的生態適應機制提供理論依據，同時為篩選有益根系內生真菌提供活體菌種資源。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

橫斷山脈縱貫我國西南部，緯度從25° N延伸至29°40′ N，北起西藏昌都，南至云南邊境，總體呈北高南低趨勢，是我國西南方地區的現代冰川分布區。該區域在27°40′ N以北垂直分帶明顯，氣候變化分明，植被分布隨海拔上升出現顯著差異[13]。橫斷山脈亞高山帶林木一直以來雖受到較好保護，但其生態環境整體脆弱，高原生態系統不穩定，且時刻面臨高山冰川消融等威脅，區域內部分地區水土流失較為嚴重[14]。

1.2 樣品采集

于2020年7月、10月分別從橫斷山脈亞高山 地 區28°45′3″～30°59′35″N,97°40′25″～102°50′18″E間的不同海拔（2610～3480 m）地區陽坡地段高山櫟林下拉設10 m×10 m樣方，于樣方內高山櫟（Q. semicarpifoliaSmith）、長穗高山櫟（Q. longispica(Hand.-Mazz.) A.Camus）及川滇高山櫟（Q. aquifolioidesRehd.et Wils.）根部0～40 cm土層沿主根采集側根至根尖，每種樹選取3棵（3株長穗高山櫟均編號GSL2）（表1）。根系樣品分兩部分，清理并分別標記，一份用干燥儲藏管存于含冰袋的保溫箱帶回，-4 ℃保存；另一份放入FAA固定液（用時稀釋一倍）保存，備后續試驗。

表1 橫斷山脈亞高山高山櫟樣地概況Table 1 Brief information of Quercus sampling plots in Hengduan Mountains

1.3 試驗方法

1.3.1 高山櫟根系內真菌侵染情況觀察 為觀察根系內潛在的AMF、DSE或其他真菌等，取去除根尖的次生根系樣本，經清水反復沖洗3～5次后剪成0.5 cm的小段。將組織小段分別放入10%KOH溶液中，90 ℃水浴1.5 h，取出重復涮洗，浸入3%乳酸溶液脫色10 min。再次涮洗，并加入0.05%苯胺藍溶液，90 ℃水浴2 h，重復涮洗脫色，至根系顏色半透明或透明，取脫色較好的根系制片觀察并記錄侵染狀況[15]。

1.3.2 共生真菌的分離與純化 流水沖洗根系樣本12 h后，取待用根系裁成0.5 cm小段。分別以70% 酒精和0.1%升汞溶液消毒10 s和1 min，以五點培養法置于PDA和MA平板上，倒置后于25 ℃培養7～14 d[16]。根系組織塊上長出真菌菌落后進行真菌轉接培養和純化，并保存菌株，經PDA和MA平板標準培養后進行形態學與分子學鑒定。

1.3.3 共生真菌的形態學鑒定 蓋玻片滅菌后呈45°斜插入菌落邊緣，置于25 ℃恒溫培養箱中培養14 d，制片并在LEICA MD750顯微鏡下觀察形態。查閱相關真菌分類書籍與文獻[17-18]，進行形態學鑒定。

1.3.4 共生真菌的分子生物學鑒定 利用改良的DNA快速提取法[19]，提取菌體基因組DNA。選用ITS1、ITS4[20]通用引物進行PCR擴增檢測真菌DNA。PCR反應體系為50 μL(ddH2O 20 μL，TaqPCR Master Mix 25 μL，ITS1 1.5 μL，ITS4 1.5 μL，DNA 2 μL)。94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s。回收PCR產物經凝膠成像系統（Molecular Imager GEL Doc TM XR）檢測。將條帶清晰的產物送生物公司（TSINGKE昆明）進行測序。

1.3.5 共生真菌多樣性數據分析 α多樣性是指以一種或幾種多樣性指數來測度和描述某一均質群落或生境內個體數在物種總數上的分配狀況[21]。本研究選取Shannon-Wiener、Simpson多樣性指數和Margalef 豐富度指數作為判斷所分離菌落的物種多樣性指標，以豐富度和均勻度相互補充說明菌種多樣性。以上述3種高山櫟根系樣本作為各真菌種類生存的生境，分離真菌總數作為高山櫟根系內可被分離的真菌總載量，各項指數數值越大，意味著該菌種的多樣性越豐富。采用EXCEL2003 Biodiv統計CFU(菌落形成單位)分離頻率等指標。經Chromas2.22和DNAMAN8軟件對目標真菌種類的序列進行峰圖查驗與序列拼接處理后，提交至NCBI利用BLAST多重對比，以相似度為97%為基準確定屬種分類關系。

2 結果與分析

2.1 高山櫟根系內生菌侵染觀察

將染、脫色處理的根系制片后在顯微鏡下觀察形態，可見根細胞內菌絲、微菌核以及暗色有隔真菌（DSE）等形態結構，觀測到DSE在根系表皮部的侵入位點。菌絲直徑6.2～15.8 μm，微菌核直徑19.3～46.7 μm（圖1-A至1-I）。根據菌絲在高山櫟根系的侵染點和形態特征，初步判斷有2種以上DSE。另外，在高山櫟根皮層細胞內觀察到大量疑似AM泡囊結構（圖1-J、1-L），判斷其為高山櫟菌根結構。該類結構在3種高山櫟根皮層細胞中均可發現，但以長穗高山櫟居多，其他兩種高山櫟較少。

圖1 3種高山櫟根系中的真菌侵染結構Fig.1 Fungal colonization and structures in roots cortex of Quercus spp.

2.2 高山櫟共生真菌的形態多樣性

顯微觀測發現3種高山櫟根皮層細胞中均存在DSE和AM等真菌結構。對3種高山櫟根系內生真菌分離培養，共獲得519株真菌，從高山櫟、長穗高山櫟、川滇高山櫟的根系中分別分離得到174株、163株、182株，經形態鑒定，共27種真菌。從種類數量上看，高山櫟根系內生真菌具有明顯的形態多樣性[21]，而且在菌落形態、顏色、生長速度、表面分泌物、菌落質地及產孢（表2）（圖2）等方面存在較大差異。

圖2 從高山櫟根系分離真菌的菌落及顯微形態結構Fig.2 The colonies and microscopic structures of fungi isolated from three speices of alpine Quercus

表2 從3種高山櫟根系中分離獲得的各真菌菌株的菌落特征Table 2 Morphology characteristics of fungal colonies isolated from three species of Quercus

2.3 高山櫟根系內生真菌的分子鑒定

對各內生真菌菌株的ITS區段序列擴增獲得長度500 bp左右的序列。在NCBI的GenBank中比對分析表明，除GSL1-7(96.96%)和GSL3-1(95.75%)可鑒定至科和屬，其余菌株與GenBank中的同源菌株相似度均高于97%[22-23]，可鑒定至種水平。通過對獲得的各菌株ITS rRNA gene序列比對分析，共鑒定出17科20屬27種真菌。文獻記載表明包括4種DSE，2種有益菌或生防菌,以及部分病原菌(表3)。

表3 橫斷山脈高山櫟根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比對結果Table 3 Blasting comparison results for rDNA ITS sequences of root endophytic fungi from three species of Quercus in Hengduan Mountains

2.4 高山櫟根系定殖真菌物種多樣性指數

通過對3種高山櫟根系內生真菌物種多樣性和豐度分析發現，其多樣性豐度表現為高山櫟＞長穗高山櫟＞川滇高山櫟。從真菌種類來看，Trichoderma tomentosum（綠色木霉）的分離頻率最高（7.13%），在3種高山櫟根系中均可分離到，其次為Fusarium acuminatum、Phoma herbarum(DSE) 和Trichocladium opacum。另3種DSE如Boeremiaexiguavar.exigua、Phialophora mustea、Paraboeremia putaminum分離頻率分別為3.47%、6.74%和5.20%；Pseudogymnoascus roseus的分離頻率為4.05%，有文獻報道該菌對植物生長有促進作用。Mucor nederlandicus分離頻率最低（0.96%），僅分離自高山櫟根系。經對3種高山櫟根系內生真菌多樣性指數分析，發現Shannon指數明顯大于1，Simpson指數均接近于1，說明3種高山櫟根系內生真菌物種多樣性較豐富，但3種高山櫟間根內真菌多樣性無顯著差異（表4）。

表4 3種高山櫟根內生真菌的α多樣性指數Table 4 α diversity indices of endophytic fungal species of three alpine species of Quercus

3 討論

對橫斷山脈亞高山帶3種高山櫟根系內生真菌分離培養共獲得519株真菌，鑒定出真菌17科20屬27種。根系染色結果表明，3種高山櫟根皮層內均存在內生真菌，可見包括菌絲、微菌核及疑似AMF的泡囊結構。3種高山櫟根內真菌α多樣性分析發現內生真菌物種多樣性較豐富，其中包含較多有益真菌或生防菌。

本研究分離鑒定出的27種真菌中，Ceratobasidiaceae科真菌（GSL1-7）為外生菌根菌[24]，其與NCBI中已知菌株序列相似度低于97%，說明該菌種為尚未被描述。Boeremia exiguavar.exigua、Phoma herbarum、Phialophora mustea及Paraboeremia putaminum為DSE。Pseudogymnoascus roseus、Trichocladium opacum、Thelonectria veuillotiana及Mucor nederlandicus曾在采自川、滇、藏等地的蟲草菌核中分離得到，其中P. roseus能夠促進植物生長并抑制病害[25-26]。綠色木霉Trichoderma tomentosum為土壤習居菌，可用于植物病害生物防治[16,26]。

Plectania rhytidia和Ilyonectria crassa曾在2種西藏藥用植物根系中分離得到[27]，此次從高山櫟根系分離獲得，說明2者在橫斷山區分布廣泛，但其對宿主植物的作用尚不明確。Kehr[28]報道Pezicula cinnamomea可侵染美國紅櫟而造成嚴重損失。Kwa?na等[29]研究從洪水浸泡后的羅布櫟(Quercus robur)分離出Pezicula radicicola，故推測這兩種真菌對高山櫟具有潛在致病性。此外，Cladosporium cladosporioides、 Dactylonectria estremocensis、D. torresensis、Pestalotiopsis kenyana、Fusarium acuminatum、F. redolens、Thelonectria veuillotiana及Ilyonectria robusta等為潛在的病原菌[30-31]。近年來，不斷有研究報道，DSE是植物根的常見內生菌[29]，且在促進植物生長、改善植物礦質營養、調節植物內源激素平衡、增強植物耐重金屬離子和抗環境污染等方面意義重大[32-33]。DSE普遍存在于高山櫟根系內，具有某種生理和生態功能，以提升高山櫟的抗逆適應能力。

高山櫟是橫斷山脈亞高山的優勢樹種，具有重要的生態價值。但本研究中喬木和灌木型高山櫟根系木質化程度均較高，不利于菌種回接。由于本研究取樣范圍和數量有限，只獲得了初步研究結果，因此，對該地區不同海拔分布的高山櫟根系內生真菌種類和功能仍有待進一步深入研究。

4 結論

本研究通過組織顯微觀察，發現橫斷山脈亞高山3種高山櫟的根皮層細胞內有菌絲、微菌核、泡囊等結構，反映出其根系普遍存在DSE等內生真菌。從橫斷山脈亞高山3種高山櫟根系中分離鑒定出3門17科20屬27種內生真菌，表明橫斷山脈亞高山3種高山櫟根內真菌物種多樣性豐富，存在菌根菌、DSE和木霉等內生真菌及部分潛在的病原菌。初步研究發現3種高山櫟根系內生真菌的多樣性豐度差異不顯著。