褐藻膠裂解酶AlyE2酶學(xué)性質(zhì)研究?

鄭 智, 張紅秀, 劉偉治, 律倩倩

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003)

褐藻膠是褐藻中含量最多的多聚糖，約占其干質(zhì)量的40%[1]，是由古羅糖醛酸(α-L-guluronate，G)及其C5的差向異構(gòu)體甘露糖醛酸(β-D-mannuronate，M)通過β-1，4糖苷鍵連接成的線性分子。根據(jù)單糖分子的排布，褐藻膠被分為三種結(jié)構(gòu)形式：多聚古羅糖醛酸(polyG)、多聚甘露糖醛酸(polyM)和M/G交替排列的polyMG。褐藻膠的降解產(chǎn)物為褐藻寡糖，并且不同聚合度(Degree of polymerization，DP)的褐藻寡糖具有不同的功能，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，來源于Pseudoalteromonassp. Strain No.272的褐藻膠裂解酶通過降解polyM和polyG產(chǎn)生的聚合度為4的褐藻寡糖來促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子，從而抑制人白血病 U937 細(xì)胞的生長[2]；由Microbulbifersp. ALW1分離的褐藻膠裂解酶，降解褐藻膠產(chǎn)生的聚合度為2～3的寡糖具有清除自由基的能力[3]；聚合度為2～7的褐藻寡糖可以延緩草莓中脫落酸的釋放，從而使草莓貯藏時間延長[4]等。褐藻膠裂解酶可以通過β-消除反應(yīng)將褐藻膠降解成寡糖和單糖[5-6]，在CAZy數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-Active Enzymes Database)分類中，褐藻膠裂解酶主要分布在PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39和PL41共14個褐藻膠裂解酶家族(Polysaccharide lyase family，PL)中，并且已報道了多個褐藻膠裂解酶結(jié)構(gòu)，主要包括4種不同的結(jié)構(gòu)形式：(α/α)n桶、β果凍卷、β折疊片和(α/α)n桶+β果凍卷的雙結(jié)構(gòu)域形式。

本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)了一株可利用褐藻膠的菌株(Vibrioalginolyticus)，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)該菌株有多種褐藻膠裂解酶基因。本研究對其中的alye2基因進(jìn)行了克隆，并利用E.coilBL21(DE3)對其進(jìn)行了重組表達(dá)，經(jīng)過鎳柱純化獲得了重組蛋白AlyE2，研究了AlyE2的底物偏好性及在不同pH、溫度和NaCl濃度的活性，并探究了NaCl濃度對AlyE2熱穩(wěn)定性的影響。

1 材料方法

1.1 實驗材料

可利用褐藻膠的菌株Vibrioalginolyticus保存于本實驗室，質(zhì)粒載體pET32a和E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞保存于本實驗室。引物合成和測序委托生工生物有限公司。PrimeSTAR HS DNA Polymerase，EcoRⅠ和XhoⅠ及T4連接酶購于Takara。Bacterial DNA Kit和Cycle Pure Kit購于OMEGE。褐藻膠購自上海源葉生物科技有限公司，polyM和polyG按文獻(xiàn)[7]方法制備，將褐藻膠在高溫下酸解，加入NaHCO3，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，高速離心得到沉淀和上清，并分別使用Na2CO3處理，使溶液pH 達(dá)到7.0，乙醇沉淀后沉淀即為polyG和polyM。其他常用生化試劑采購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AlyE2的序列分析 通過在線軟件SMART分析蛋白的信號肽與結(jié)構(gòu)域[8]；通過ProtParam tool預(yù)測蛋白分子量和等電點等性質(zhì)[9]；通過NCBI在線工具BLASTP對AlyE2的相似蛋白進(jìn)行檢索；檢索 CAZy數(shù)據(jù)庫得到PL7家族褐藻膠裂解酶序列，利用本地軟件MEGAX[10]進(jìn)行多序列比對，并使用ESPrit 3.0在線軟件[11]對多序列比對結(jié)果進(jìn)行展示。使用MEGAX采用鄰接法(Neighbor-Joining method)，設(shè)置Bootstrap為1 000次，建立進(jìn)化樹確定酶的分類。

1.2.2 AlyE2的表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)基因序列對去除信號肽的基因片段設(shè)計并合成PCR引物，引物序列如下F：gctgatatcggatccgaattcTCAAATATCAATGTTG GTCAACAATT；R： gtggtggtggtggtgctcgagTTATTGATTGAGAATTAACTGGTAGAAGC，下劃線分別代表：EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點。利用Bacterial DNA Kit提取V.alginolyticus的基因組，以基因組作為模板，按以下反應(yīng)體系：dNTP mix 4 μL，5×Primer Buffer 10 μL，正反向引物各 1.5 μL(10 μmol/L)，基因組20 ng，加入ddH2O至50 μL體系。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性5 s；55 ℃退火10 s；72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。按以上反應(yīng)條件反應(yīng)得到目的序列，雙酶切后連接至pET32a載體，轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行測序。

1.2.3 AlyE2的表達(dá)與純化 將種子液按1%(v/v)接種于1 L的含有100 μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)1 h 40 min，至菌液OD600為0.4～0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，轉(zhuǎn)移至16 ℃過夜培養(yǎng)。離心收集菌體，加入結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑)重懸菌體，超聲功率300 W，工作/停止間隙為2 s/4 s，共持續(xù)25 min，高速離心后收集上清。使用Ni-NTA瓊脂糖重力柱結(jié)合目的蛋白，使用結(jié)合緩沖液充分清洗后，加入10 mL緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，500 mmol/L NaCl)，加入0.1 mg PreScission蛋白酶[12]，柱上酶切3 h，收集流出作為粗酶。利用考馬斯亮藍(lán)法確定蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清蛋白，利用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)和純化情況。

1.2.4 酶活力測定與酶學(xué)性質(zhì)檢測

1.2.4.1 酶活力測定 采用OD235法測定反應(yīng)體系中不飽和雙鍵來確定酶活。按如下反應(yīng)體系反應(yīng)：0.2%(m/v)褐藻膠，20 mmol/L pH為7.5的磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4，PB)，1.0 mol/L NaCl，反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時間10 min，每組反應(yīng)設(shè)置3個平行，測定OD235的變化值，將每分鐘內(nèi)OD235增加0.1定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.4.2 底物特異性與酶解產(chǎn)物分析 為研究AlyE2的底物特異性，分別檢測AlyE2降解polyM、polyG和褐藻膠反應(yīng)體系在235 nm下的吸光值的變化。通過薄層色譜層析(TLC)檢測酶解過程的產(chǎn)物分布[13]，分別取1、3、10、30、60 min的樣品，100 ℃滅活5 min，12 000g離心1 min，取2.5 μL反應(yīng)后產(chǎn)物點樣于硅膠板(生產(chǎn)商：Merck，默克)，用展開劑(正丁醇∶甲酸∶水=4∶6∶1，v/v/v)展開樣品，結(jié)束后吹干硅膠板，噴灑顯色劑(二苯胺2 g，苯胺2 mL，丙酮100 mL，磷酸10 mL，濃鹽酸1 mL)并在高溫下顯色。

1.2.4.3 NaCl濃度、金屬離子及有機試劑對酶的活力影響 測定NaCl濃度對AlyE2酶活的影響時，將反應(yīng)體系中NaCl的濃度調(diào)整為0～3.0 mol/L；測定金屬離子對AlyE2酶活的影響時，將AlyE2分別與1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、K+、Ca2+和Ni2+溶液混合，在4 ℃孵育1 h；測定有機試劑對AlyE2酶活的影響，將乙醇、異丙醇、正丁醇和甲苯按10%(v/v)的比例 加入反應(yīng)體系中。上述反應(yīng)體系，按1.2.4.1中方法來測定AlyE2的活力。

1.2.4.4 最適溫度和最適pH 為檢測AlyE2的最適溫度，按1.2.4.1中方法，分別在20、25、30、37、40、50和60 ℃測定酶活力。為檢測AlyE2的最適pH，使用的20 mmol/L的pH 緩沖液(pH為5.0～6.0的Na-Acetate buffer、pH為6.0～7.5的Na-Phosphate buffer、pH為7.5～8.0的Tris-HCl buffer、pH為8.0～9.0的Bicine-NaOH buffer、pH為9.0～11.0的Glycine-NaOH buffer)，按1.2.4.1中方法測定酶活。

1.2.4.5 動力學(xué)參數(shù)確定 按照1.2.4.1中方法檢測在不同濃度底物條件下AlyE2的反應(yīng)速率[14]，測試的底物為0.4～4.0 mg/mL的褐藻膠，測定反應(yīng)1 min內(nèi)的反應(yīng)速率。利用數(shù)據(jù)處理軟件OriginPro擬合米氏曲線計算動力學(xué)參數(shù)，使用消光系數(shù)ε=6 150 mol-1·L·cm-1[15]計算最大反應(yīng)速度Vmax。

1.2.4.6 NaCl濃度與蛋白熱穩(wěn)定性的關(guān)系 將AlyE2分別透析至含有0、0.5、1.0、2.0和3.0 mol/L NaCl的20 mmol/L PB溶液中，將不同緩沖液中的蛋白濃度均調(diào)整至1 mg/mL。利用差示掃描微量熱儀(MicroCal PEAQ-DSC，Malvern)檢測不同NaCl濃度下蛋白隨溫度變化的熱量變化，對照組為每個鹽濃度透析后的透析外液，檢測溫度范圍為 15～80 ℃。利用non-two-state擬合模型，計算AlyE2在不同鹽濃度的熔解溫度Tm。

2 結(jié)果與討論

2.1 AlyE2為PL7_5家族褐藻膠裂解酶

AlyE2全長345個氨基酸，其中N端的前20個氨基酸為信號肽，除去信號肽共325個氨基酸殘基，預(yù)測的分子量大小(MW)為36.0 kDa，預(yù)測的等電點(pI)為6.45。通過BLASTP工具檢索AlyE2全長，AlyE2與PL7家族蛋白(GeneBank: WP_102290480.1)相似度達(dá)到100%。與CAZy中PL7家族已表征的褐藻膠裂解酶比較，同AlyE的序列相似度最高(95.07%)。得到PL7家族的全部蛋白序列，通過多序列比對確定AlyE2具有在PL7家族中保守的RXEXR、Q(I/V)H和YXKAGXYXQ(見圖1)。依據(jù)多序列比對的結(jié)果建立進(jìn)化樹(見圖2)，確定AlyE2屬于PL7家族的第五亞家族(PL7_5)。

(所有序列來源于CAZy數(shù)據(jù)庫PL7家族已表征蛋白，亞家族確定依據(jù)CAZy數(shù)據(jù)已有的分類。構(gòu)建進(jìn)化樹采用鄰接法且Bootstrap設(shè)置為1 000次。All sequences are derived from the characterized protein of the PL7 family in the CAZy database. The subfamily is determined based on the existing classification of the CAZy. The phylogenetic tree is constructed using the neighbor-joining method and bootstrap analysis of 1 000 replicates is conducted.)

2.2 通過重組表達(dá)與蛋白分離純化獲得重組AlyE2蛋白

對構(gòu)造的重組載體測序，核酸電泳結(jié)果顯示克隆產(chǎn)物分子量大小約為1 300 bp(見圖3(a))，與預(yù)測大小相符，表明重組載體pET32a-alye2構(gòu)建成功。如圖3(b)所示，超聲后上清中出現(xiàn)一條大小在44.3 kDa 附近的較粗的蛋白條帶(紅色箭頭)，能與Ni-NTA結(jié)合，柱上酶切去除標(biāo)簽后最終獲得一條36 kDa左右蛋白條帶，純化的重組蛋白的產(chǎn)率為10 mg/L。

((a)1：DNA Marker；2：alye2克隆片段;(b)1：蛋白Marker；2：表達(dá)菌體裂解液(箭頭示Trx-His(6)-AlyE2融合蛋白)；3：純化的AlyE2。(a) Lane_1: DNA Marker；Lane_2: alye2;(b) Lane_1: protein markers; Lane_2: crude extracts from E. coli (arrow for Trx-His(6)-AlyE2); Lane_3: purified AlyE2 without tags.)

2.3 重組蛋白AlyE2酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 AlyE2是polyG特異性的褐藻膠裂解酶，主要產(chǎn)物是三糖 檢測AlyE2對3種底物的酶解曲線，AlyE2對polyG有明顯降解偏好性，對褐藻膠的降解速率比polyG低，對polyM幾乎不降解，說明AlyE2是polyG特異性的褐藻膠裂解酶(見圖4(a))。從降解過程分析，AlyE2對polyG和褐藻膠的降解，最終產(chǎn)物為DP為3～5的寡糖，其中三糖為主要產(chǎn)物(見圖4(b)、(c))。

(AlyE2的底物偏好性(a)、褐藻膠降解產(chǎn)物分布(b)和polyG降解產(chǎn)物分布(c)。AOs：DP 2～4的褐藻膠寡糖； 1～5分別表示反應(yīng)1、5、10、30、60 min的產(chǎn)物。Analysis of substrate specificity of AlyE2 (a), products distribution of alginate (b) and products distribution of polyG (c). Lane_ AOs: Unsaturated oligosaccharides(DP 2～4)； Lane_ 1～5: the degradation products at 1、5、10、30 and 60 min，respectively. )

2.3.2 金屬離子和有機試劑對AlyE2活性影響 Mn2+和Ca2+對AlyE2活性有明顯的促進(jìn)作用，可以使活性增加40%； Cu2+、K+和Ni2+對AlyE2有抑制作用(見圖5)。AlyE2在乙醇、異丙醇、正丁醇中能達(dá)到最高活性的20%～60%，在甲苯中能達(dá)到最高活性的70%，說明AlyE2可以在有機試劑中發(fā)揮作用，具備在有機環(huán)境應(yīng)用的潛能。

圖5 金屬離子和有機試劑對AlyE2活性影響

2.3.3 AlyE2最適溫度和最適pH 如圖所示AlyE2的最適溫度為30 ℃(見圖6(a))，在20 ℃表現(xiàn)出最高活性的60%，當(dāng)溫度高于50 ℃時，蛋白喪失活性。AlyE2的最適pH為7.5，且在堿性環(huán)境(pH為7.0～9.0)中表現(xiàn)出較高的活性(見圖6(b))。PL7家族的最適溫度范圍和最適pH范圍分別為30～55 ℃和7.0～9.0[16]，AlyE2的最適溫度和最適pH也在該范圍內(nèi)，該性質(zhì)也與宿主海洋生活環(huán)境相適應(yīng)。

圖6 溫度(a)和pH(b)對AlyE2活性的影響

2.3.4 AlyE2的動力學(xué)參數(shù) AlyE2的動力學(xué)曲線如圖7所示，通過計算得到最大反應(yīng)速率Vmax為(39.62±0.11) μmol·L-1·min-1；米氏常數(shù)Km為(0.31±0.04) mg/mL。

圖7 AlyE2降解褐藻膠的米氏曲線

2.3.5 AlyE2的活性和熱穩(wěn)定性均隨NaCl濃度升高而增強 NaCl對AlyE2活性的影響較大，在0～1.0 mol/L范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度升高，活性逐漸變強，NaCl濃度力1.0～2.0 mol/L時，能明顯促進(jìn)AlyE2的活性，活性是對照組(NaCl濃度為0 mol/L)的2.5倍(見圖8(a))。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到1.0～2.0 mol/L時，AlyE2活性保持在最高活性的95%以上，表現(xiàn)了AlyE2對高鹽環(huán)境的適應(yīng)性。同時通過本研究還發(fā)現(xiàn)AlyE2的熱穩(wěn)定性也與NaCl濃度有關(guān)，如圖8(b)所示，與對照組濃度下相比，在NaCl濃度1.0～2.0 mol/L的條件下，AlyE2的Tm提高8～14 ℃，這說明NaCl可以提高AlyE2的熱穩(wěn)定性。綜合NaCl對AlyE2活性及熱穩(wěn)定性的分析結(jié)果推測，NaCl濃度提高后AlyE2活性的升高可能與其穩(wěn)定性的提高有關(guān)。

圖8 不同NaCl濃度對AlyE2活性(a)和熱穩(wěn)定性(b)的影響。

AlyE2的活性受NaCl濃度的影響，該現(xiàn)象也在PL7家族已表征的褐藻膠裂解酶中有所報道。例如，AlyA最適NaCl濃度在1.0 mol/L，其活性約為對照組的10 倍[17]；AlyPM最適鹽濃度在0.5～1.0 mol/L，其在NaCl濃度為1.0 mol/L時的活性是對照組的6倍左右[18]；AlyA-OU02最適鹽濃度為0.2～1.0 mol/L，其在NaCl濃度為1.0 mol/L時的活性是對照組的2倍[19]；深海微生物來源的Nit-Aly最適鹽濃度為0.8～1.4 mol/L，其在NaCl濃度為1.0 mol/L時的活性是對照組的20倍以上[20]；AlyM4最適NaCl濃度為1.0 mol/L，其活性是對照組的7 倍以上[21]；AlyC3最適NaCl濃度為0.5 mol/L，但當(dāng)NaCl濃度達(dá)到3.0 mol/L時，酶活仍比對照組高25%[22]。雖然PL7家族褐藻膠裂解酶對NaCl表現(xiàn)的依賴性的現(xiàn)象非常常見，但對其機理的研究很少。AlyC3也是PL7家族對NaCl表現(xiàn)出依賴性的褐藻膠裂解酶，NaCl濃度可以對AlyC3的聚集狀態(tài)產(chǎn)生影響，其中AlyC3二聚體具有活性，而其他聚集形式都未表現(xiàn)明顯的活性，所以NaCl濃度的變化導(dǎo)致蛋白的聚集狀態(tài)發(fā)生變化，從而使活性改變[22]。參照文獻(xiàn)[22]的方法，發(fā)現(xiàn)NaCl濃度未對AlyE2的聚集狀態(tài)產(chǎn)生影響。當(dāng)NaCl濃度為0～2.0 mol/L時，溫度穩(wěn)定性的不斷增強，酶活也逐漸升高，可以推測AlyE2的溫度穩(wěn)定性不斷增強可能是其酶活不斷升高的重要因素；當(dāng)NaCl濃度大于2.0 mol/L時，雖然溫度穩(wěn)定性持續(xù)增強，但考慮在此濃度下蛋白因為強疏水作用和高離子強度等因素可能使酶活出現(xiàn)迅速下降的情況，最終使得AlyE2活性出現(xiàn)迅速下降。

3 結(jié)語

AlyE2是PL7家族具有polyG降解偏好性的內(nèi)切型褐藻膠裂解酶，最適溫度和pH分別為30 ℃和7.5，在1.0 mol/L NaCl濃度下活性最高，且當(dāng)NaCl濃度升高到2.0 mol/L時，AlyE2仍能保持高活性，體現(xiàn)了AlyE2對高鹽環(huán)境的適應(yīng)性。本文還發(fā)現(xiàn)NaCl能增強AlyE2的熱穩(wěn)定性，可能是其活性升高的重要因素。AlyE2降解褐藻膠的產(chǎn)物為DP 3～5的寡糖分子，在生物活性寡糖制備方面有潛在應(yīng)用價值。