青貯原料表面微生物研究進展

張鳴珠， 黃 媛， 吳長榮， 朱 欣， 李龍興， 陳光燕， 郝 俊*

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省草地技術試驗推廣站，貴州貴陽 550025；3.貴州眾智恒生態科技有限公司，貴州貴陽 550025）

青貯是一種將新鮮的飼草料切短裝入密封的容器中，利用原料中附著的微生物或接種添加劑在厭氧條件下將牧草中的可溶性碳水化合物進行發酵并生成多種有機酸（主要是乳酸），導致酸堿度降低以抑制腐敗和病原微生物,從而使飼料延長保存時間和保留營養價值的工藝。青貯飼料是一個厭氧發酵過程，由收獲時在作物上附著的微生物驅動。不同的作物品種可以在根際、葉際和根內中選擇性地組裝各種微生物。與植物相關的微生物群在調節各種生物過程中起著至關重要的作用，并影響植物生長和發育所涉及的各種性狀，以及植物對不利環境條件的反應（Lei等，2020；Wagner等，2020）。不同作物間的附生微生物組成不同，其對飼草青貯發酵品質的貢獻也有差異。新鮮飼草表面微生物由細菌、酵母和霉菌的復雜混合物組成。一旦開始發酵，微生物群的多樣性就會降低，因為專性需氧菌和酸敏感微生物被殺死，或者由于排除氧氣和產酸降低了酸堿度而無法使其生長。在這些特殊條件下,附生的乳酸菌、腸細菌、酵母菌和霉菌會進入一種存活但不可培養的狀態（Mcallister等，2018）。已有研究表明，由于作物表面附生乳酸菌數量較少，熱帶牧草的發酵青貯品質較差（Pholsen等，2016）。因此形成了一個共同的觀點，即較高的乳酸菌初始計數保證了良好的發酵（Zhang等，2000）。Li（2019）和Zhang（2000）等的研究表明，與溫帶禾草相比，熱帶禾草具有較高的異源發酵乳酸菌群體，導致乙酸鹽類型的發酵。此外，Kasmaei（2017）和Ferreira（2015）記錄了不同牧草間附生乳酸菌數量的變化及其對青貯發酵質量的影響。因此，研究不同作物間的附生微生物區系分布及其對青貯發酵產生的影響十分必要。揭示作物的附生微生物組成，評價附生微生物群落對青貯發酵特性的貢獻，可以為飼草品種選擇提供參考。與青貯過程相關的附生微生物種群非常復雜，每種作物都有其特殊性，只有充分了解微生物多樣性，才能改善發酵。本文就青貯飼料表面微生物組成、影響微生物種群的因素以及作物表面附著微生物對青貯發酵品質和有氧穩定性的影響等方面的研究進展作一綜述。

1 青貯原料附著微生物

1.1 青貯原料表面附著微生物 青貯飼料的微生物群落主要來自飼料作物的葉層和下部莖。群落的組成根據作物品種及其生長環境而變化，甚至植物不同部位上附著微生物也有所差異（施雯等，2007）。Ruru（2021）對同一區域內六個不同品種玉米表面微生物進行研究發現，六個新鮮玉米品種的附生微生物群存在差異。泛菌屬是所有新鮮玉米品種中最主要的附生細菌，然而六個玉米品種之間的次優勢屬絕對不同。Pang（2012）從青藏高原的玉米、苜蓿、三葉草、紅豆草和印度鵝掌楸中分離到140株乳酸菌，并發現玉米比其他飼料作物含有更多的乳酸菌。假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）、乳酸乳桿菌（Lactococcus lactis subsp.lactis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和副真乳桿菌（Weissella paramesenteroides）分別是苜蓿、三葉草、紅豆草和印度鵝掌楸上乳酸菌種群的優勢種。

青貯發酵取決于不同微生物群之間的競爭。因此，附生微生物群指導初始發酵并影響青貯飼料的發酵動態和模式。揭示牧草附生細菌群落有助于全面了解牧草發酵動態，提高牧草發酵質量（Xu等，2017）。存在植物表面上的微生物主要有：乳酸菌、酵母菌、腸細菌、霉菌、醋酸菌和其他好氧性細菌等（Rao等，2018；倪奎奎，2016；楊文琦等，2013），這些微生物各司其職，在青貯發酵過程中發揮著積極或消極的作用。厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是青苗期間數量最多的門（Liu等，2019；Ogunade等，2017）。乳酸菌和丙酸桿菌被認為是有利于青貯過程的細菌（Keshri等，2018）。乳酸菌一方面可以將青貯原料中的碳水化合物作為碳源通過催化發酵產生乳酸、醋酸、丁酸，提高氫離子濃度，從而達到酸性條件，抑制可能導致青貯產品腐敗變質的有害微生物正常生長的目的；另一方面乳酸菌還具有與有害微生物競爭營養物質并產生細菌素等代謝物質的能力（Cai等，1999）。但一般情況下，由于植物附著乳酸菌較少不足以發揮其抑制作用，所以需要通過外源添加劑來幫助發酵（Amaral等，2020；Fabiszewska等，2019；Wilkinson等，2019）。隨著對青貯乳酸菌發酵作用的不斷深入研究，有些專家學者也先后提出了不同的觀點，Gollop（2010）等發現，乳酸菌發酵過程中所產生的過氧化氫、細菌素以及一些目前不完全可知的代謝物也可以對青貯料中的各種微生物生長繁殖起到一定的抑制作用，這些積累的代謝物甚至也可能會抑制乳酸菌自身的生長。丙酸桿菌（Propionibacterium）的主要發酵產物為丙酸、醋酸、丁二酸以及二氧化碳（Thierry等，2011），丙酸和乙酸均為弱酸，具有抗真菌作用。

原料表面附著的酵母菌、霉菌等有害微生物會代謝產生霉菌毒素、丁酸、蛋白水解產物和細菌毒素等化合物，會導致青貯飼料的腐敗變質、降低營養成分甚至會影響牲畜健康（Peng等，2017；Silva等，2015）。腸桿菌（Enterobacteriaceae）、醋酸菌、孢子形成菌 （芽孢桿菌Bacillus和梭菌Clostridium）和李斯特菌（Listeria）被認為是不理想的細菌（Pahlow等，2015）。一般認為芽孢桿菌對青貯發酵沒有積極意義，因為芽孢桿菌在嚴格的厭氧條件下也能生長，能發酵有機酸和蛋白質并參與青貯飼料的有氧發酵過程。但某些枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）不僅可有效抑制青貯過程中霉菌生長,在有氧暴露后防止飼料腐敗變質亦起到積極作用。Phillip（1992）等發現短小芽孢桿菌（Bacillus cereus）在防止高濕度紫花苜蓿霉變方面有顯著成效，這可能與某些芽孢菌可產細菌素有關。醋酸桿菌屬（Acetobacterium）對青貯飼料發酵具有消極作用，因為好氧的醋酸菌屬可以迅速氧化乳酸和乙酸，導致青貯料酸性程度降低，同時干物質以二氧化碳和水的形式散失，從而引起青貯料因耗氧而腐爛變質（Vila等，2019）。很多研究表明，泛菌屬在新鮮材料中顯示出較高的相對豐度，但在青貯過程中急劇下降（Ruru等，2021；Zhihao等，2020；Ni等，2017）。Keshri（2018）等發現，小麥鮮樣中的泛菌屬豐度為34.7%，青貯6 h后達到46.3%，但隨后持續下降，至青貯90 d后僅占0.02%。但泛菌屬在新鮮作物中的作用及其消失原因仍不清楚，需要進一步研究。

1.2 附著微生物種群地理分布特征及影響因素微生物在發酵過程中發揮著重要的作用，因此了解影響微生物種群變化的因素就尤為重要。環境條件影響青貯飼料生產和利用的所有階段（Bernardes等，2018）。氣候可以通過決定一個地區的環境條件（如土、水、氣、熱等）來影響植物表面附著微生物的生長，從而間接地對青貯飼料品質發生作用（Gharechahi等，2017），比如在濕熱的生長環境下植株表面更容易產生青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和鐮刀菌屬（Fusarium）的霉菌（Samapundo等，2005）。

不同區域間的微生物可能會有一定的分布特征。韓吉雨（2009）指出，因為地區間大環境的變化，導致植物表面附著微生物不同，其中乳酸菌的變化，使作物青貯發酵品質出現差異。他對不同地區青貯玉米和苜蓿的細菌群落特征進行研究，發現同一區域作物原料表面附著的微生物種類總體相似性高達80%～93%。不同區域作物原料表面附著的微生物種類總體相似性較低，最高地區只有75%。而對同一或是不同地區青貯中細菌及乳酸菌的差異都很顯著。包維臣（2019）發現，種植于內蒙古牧場的苜蓿青貯前主要細菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）、歐文氏菌屬（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡 萄球菌屬（Staphylococcus），而Mc garvey（2013）等發現，種植在美國加州大學試驗田內的苜蓿在青貯前主要菌屬為歐文氏菌屬、埃希菌屬（Escherichia）、假單胞菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter），表明不同區域和不同青貯原料品種間表面微生物多樣性存在一定差異。

區域因素如溫度、濕度、降水等，這些被認為是影響植物表面微生物多樣性的主要因素（Muck等，2018）。Guan（2018）等發現，降雨和濕度影響玉米原料上的附生細菌群落，溫度影響青貯過程中細菌種類的豐富度。降水量與青貯原料上乳桿菌屬、醋桿菌屬（Acetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）的相對豐度之間存在顯著正相關關系。溫度與甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鞘 氨 醇 單 胞 菌 屬（Sphingomonas）、Aureimonas和德沃斯氏菌屬（Devosia）的相對豐度呈負相關關系；然而，濕度與這些細菌的數量呈高度正相關，說明這些有害微生物適合在涼爽濕潤的氣候中生長。青貯后，盡管氣候因素不影響青貯飼料中主要細菌的相對豐度（如乳酸桿菌、醋桿菌和明串珠菌），但溫度會顯著影響青貯期間的細菌物種豐富度。梁龍飛（2020）也對貴州不同區域全株玉米青貯過程中的菌群動態進行研究，發現細菌物種豐富度與溫度呈極顯著負相關，細菌群落多樣性與降雨呈極顯著負相關，乳桿菌屬細菌相對豐度與溫度呈顯著負相關，這與Guan（2018）的研究中乳桿菌屬相對豐度與溫度呈正相關的結論不同。對于青貯微生物在不同地區和對不同氣候條件的響應研究較少，有關這方面的討論還要做進一步研究。

氣候決定一個地區的環境條件，而海拔又是影響該地區氣候變化的關鍵因素，海拔通過對氣候的影響，可以間接地對植物和微生物的生長和生理特性產生作用。張娟（2017）研究發現，海拔與垂穗披堿草附著乳酸菌數量呈正相關關系，與酵母菌數量呈負相關關系，對霉菌數量的影響不顯著。但青貯時間和海拔的互作對霉菌的數量、pH、乳酸、乙酸含量影響極為顯著。陸永祥（2020）研究了不同海拔高度燕麥青貯的細菌群落，結果發現隨著海拔升高，燕麥青貯飼料中乳酸菌的相對豐富度增加，而梭菌等不良細菌的相對豐富度降低；隨著青貯發酵的進行，一些耐低溫和厭氧微生物如乳桿菌和明串珠菌開始出現，而好氧嗜溫的微生物如魏斯氏菌屬和梭狀芽孢桿菌等降低。

2 附著微生物對青貯發酵的影響

2.1 附著微生物對青貯發酵品質的影響 青貯需要經過有氧呼吸階段、厭氧發酵階段、穩定貯藏階段和有氧暴露階段（Pahlow等，2015）。在此過程中青貯原料表面附著的多種真菌和細菌進行代謝繁殖并表現出一定的規律性。張慧杰（2011）指出，發酵過程中各種微生物的數量基本上呈現緩慢變化、迅速增加、達到最大值后下降、最后穩定在較低水平的動態過程，青貯過程中微生物數量會出現兩至三次升降變化。微生物的這一系列變化將引起青貯原料發生物理化學改變，從而影響最終青貯飼料營養和發酵品質。

青貯發酵的有氧呼吸階段，植物呼吸作用和附著在青貯原料表面的假單胞菌屬、埃希氏菌屬和芽孢桿菌屬等微生物開始利用作物的蛋白質和糖類進行繁殖代謝 （Vila等，2019；Shao等，2005），碳水化合物將被分解為氨基酸、乙酸、二氧化碳和水，降低飼料的青貯品質（Vila等，2019；Borreani等，2018）。有研究表明，當青貯飼料中的霉菌含量大于105CFU/g時，青貯營養品質會發生很大變化，淀粉含量開始下降，干物質（DM）損失大于20%；當霉菌數超過106CFU/g時，青貯DM的損失可能超過40%；當霉菌數高于107CFU/g青貯飼料時，DM含量低于10%（Borreani等，2018）。隨著發酵的進行，在含有足夠可溶性碳水化合物的壓實良好的青貯飼料中，乳酸菌因其適應性特點在厭氧發酵階段占主導地位，同時大量產生有機酸，貯藏環境酸性增強而抑制雜菌并提高青貯飼料的營養價值。Ruru（2021）和Zhihao（2020）報道，與新鮮牧草相比，青貯飼料中細菌群落的多樣性和豐富度下降，并導致一些附生細菌的消失，因為其對青貯飼料中厭氧和酸性條件的適應性較低。此外乳酸菌在繁殖過程中與其他雜菌進行營養競爭也會抑制有害微生物的繁殖，從而改善青貯品質。發酵結束后乳酸菌成為大多數青貯飼料中的優勢菌屬。Keshri（2018）等研究表明，乳酸桿菌最初以非常低的豐度出現，但青貯90 d后相對豐度持續增加到59.5%。Guan（2018）等的研究報告了類似的結果，發現乳桿菌是玉米青貯飼料自然發酵中的優勢微生物屬（＞50%）。Gharechahi（2017）和Ogunade（2017）等研究表明，在整個青貯過程中，所有作物樣品中乳酸菌的豐度都在上升。雖然不同種類和特性的附生乳酸菌會改變和影響發酵進程和青貯飼料的質量，但附生乳酸菌的種群并不總是足夠多或具有合適的組成以促進有效發酵（Pang等，2012），難以達到低pH環境，反而導致梭菌活動旺盛，蛋白質分解加劇，致使青貯飼料品質下降。因此，許多學者研究如何通過接種微生物添加劑對青貯飼料中的微生物區系進行調控，增強第二和第三階段發酵效率，有效提高青貯飼料的品質（Guan等，2020；Xu等，2020；Keshri等，2018）。不同種屬的乳酸菌對青貯料的發酵品質和營養品質的影響不同，這是因為不同乳酸菌利用碳水化合物發酵產生的代謝產物不同。已有研究表明，乳酸主要由乳桿菌屬和片球菌屬中的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、黑氏乳桿菌（Lactobacillus hammesii）、類消化乳桿菌 （Lactobacillus paralimentarius）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）5個細菌菌種相互促進代謝產生，而乙酸和苯乳酸主要由植物乳桿菌和短乳桿菌產生（包維臣，2019）。

外源微生物添加技術可極大改善青貯發酵品質，但附著微生物的作用依然不可小覷，通過研究原料中附著的微生物以研發專用的微生物添加劑已成為微生物研究的熱門領域。Wang（2020）等將玉米和高粱植株的附生菌群接種到燕麥中，發現其他牧草的附生微生物改變了青貯燕麥的微生物群落和青貯品質。黃峰（2020）等從甘蔗尾中提取附生微生物接種到象草和玉米秸稈中進行青貯，發現象草青貯飼料中粗蛋白質含量顯著增加，而玉米秸稈青貯飼料中粗蛋白質含量沒有顯著增加，結果表明甘蔗尾附生菌能夠迅速降低玉米秸稈和象草青貯中的pH，從而抑制

蛋白酶的活性和不良微生物的生長繁殖。已經有研究表明，與商業乳酸菌接種劑相比，接種附生乳酸菌的發酵效率更高（Yahaya等，2004）。在較高溫度（50℃）下，商用乳酸菌接種劑如植物乳桿菌MTD-1（Lactobacillus.plantarumMTD-1）對青貯飼料質量沒有積極影響，而兩種篩選的附生乳酸菌菌株，乳酸乳桿菌GG13（Lactobacillus.acidilacticiGG13）和鼠李糖乳桿菌GG26（Lactobacillus.rhamnosusGG26）提高了青貯飼料質量（Gulfam等，2017）。

2.2 附著微生物對青貯發酵有氧穩定性的影響植物表面除了附著少部分有利于青貯發酵的微生物外，大部分附著著酵母菌、霉菌、梭菌、腸細菌等不利于青貯發酵的微生物，它們會引起飼料的腐敗變質，甚至造成牲畜的食物中毒。開窖后的細菌群落會發生很大變化（Hu等，2018），乳酸菌數量開始下降。劉蓓一（2019）觀測到有氧暴露第5天的乳酸菌數量最低，此時的優勢菌群由乳桿菌屬（Lactobacillus）轉變為厚壁菌門和變形菌門的其他菌。空氣對青貯飼料十分有害，可以使休眠的好氧微生物開始繁殖，降低青貯飼料的有氧穩定性。研究表明，開窖時酵母菌的數量與其有氧穩定性直接相關，青貯飼料的有氧穩定性較低時酵母菌或霉菌含量往往超過105CFU/g（Borreani等，2018；Ranjit等，2000）。這是因為酵母菌在pH 3.5時仍具有活性（包維臣，2019），并且能代謝乳酸和可溶性糖，從而提高pH，使青貯的內部溫度升高，而形成的低酸性環境將無法對霉菌和李斯特菌（Listeria monocytogenes）等微生物產生抑制作用（Woolford，2010），最后導致青貯飼料的腐敗。霉菌是青貯前期有氧呼吸階段和有氧暴露后導致青貯飼料腐敗變質的主要微生物。霉菌在繁殖過程中產生的真菌毒素并不影響青貯進程，但會對牲畜的生長和生產性能造成危害，不同菌種產生毒素的種類差異較大。從青貯有氧穩定性的角度出發，酵母菌的種類比數量更為重要，且通常與曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬的生長有關，已經有研究發現即使某些青貯飼料中存在較多數量的酵母菌（大于104CFU/g FM）也能具有良好的有氧穩定性（Hu，2015）。而可以抑制這些有害微生物的乳酸菌對青貯飼料有氧穩定性的影響也是積極與消極并存的。作物中附著的同型發酵乳酸菌雖然具有可快速降低pH，減少干物質損失的優點，但是對青貯全株玉米有氧穩定性方面會產生負面影響，根據Muck（2018）報告，有1/3的研究發現同型乳酸菌降低了有氧穩定性，這在玉米青貯中比在牧草或豆科青貯中發生的多。而通過PK、HK途徑發酵的異型乳酸菌能產生乙酸和丙二醇，這些短鏈脂肪酸是一種更有效的抑制酵母菌、霉菌等有害微生物的酸類物質，從而提高青貯飼料的有氧穩定性（Ferrero等，2018；Muck等，2018）。不僅如此，還發現異型發酵乳酸菌代謝產物中的細菌素、Renterin、抑菌肽和苯乳酸等物質也能夠有效抑菌。其中對苯乳酸的研究更為廣泛。研究表明，部分乳酸菌通過氨基轉移酶將苯丙氨酸轉化成苯丙酮酸，而后經過乳酸脫氫酶作用生成苯乳酸 （蘆夏霏等，2014）。Ganzorig（2016）等從青貯中分離得到稀氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii），發現這種菌株代謝產生的苯乳酸和4-羥基苯乳酸對霉菌具有較強的抑制效果。

3 小結

微生物組學的不斷發展為研究植物與微生物相互作用提供了一種有效的方法，促進了對整個植物相關微生物群落的研究。本文就不同作物間的附生微生物組成，附生微生物群落對飼草青貯發酵特性的貢獻作一綜述。青貯飼料的品質受到發酵過程中所涉及的微生物群落及其產生的代謝產物的影響。已經有較多研究集中于青貯設備、青貯環境、添加劑等人為因素對微生物群落的影響，從而改善青貯發酵品質和有氧穩定性，但是缺乏附生微生物群落對海拔、降雨量、溫度、日照強度等自然因素響應以及附生微生物群如何影響青貯發酵的研究，飼料表面微生物是個復雜的體系，其對青貯發酵的影響亦是非常重要，需要更多的研究來了解附生微生物群如何影響青貯發酵進程。