辣椒種質材料疫病抗性鑒評及遺傳多樣性分析

徐曉美，李 穎，孫啟迪，徐小萬，衡 周，李 濤，王恒明

（1.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.茂名市茂蔬種業科技有限公司，廣東 茂名 525000）

【研究意義】1 年生辣椒（Capsicum annuum）是5 個辣椒栽培種中最重要的栽培種，因其風味多樣、營養豐富，深受消費者喜愛，同時既可鮮食又可加工，具有重要的產業價值。在廣東地區，辣椒是南菜北運最重要的蔬菜，廣東省年辣椒播種面積達10 萬hm2左右，居全省蔬菜播種面積的第2 位。然而，因廣東地區高溫高濕，辣椒疫病病害嚴重，對辣椒生產造成重大損失，篩選抗疫病種質材料、培育抗疫病辣椒品種是一條經濟、環保且有效的途徑［1］。另外，種質材料的遺傳多樣性是作物育種的前提，是種質評價和利用的基礎，同時也為基因資源的發掘提供必要信息。【前人研究進展】辣椒疫病由辣椒 疫霉菌（Phytophthora capsiciLeonian）引起，是一種發病周期短、傳播速度快的土傳病害［2］。目前生產上對該病害的防治主要依賴化學藥劑，這不僅增加生產成本，同時也對環境造成污染。因此，選育抗病品種才是一條經濟、環保且有效的途徑，而實現該途徑的第一步則是做好辣椒抗疫病種質資源的鑒定和篩選。何烈干等［3］利用游動孢子灌根法對208 份辣椒種質材料進行疫病抗性鑒定，篩選出高抗材料18 份、抗性材料23 份；關天舒等［4］利用相同樣方法在國內外共217 份辣椒種質材料中鑒定并篩選出高抗材料84 份、抗病材料57 份，兩者篩選結果差異較大。在種質材料遺傳多樣性研究中，形態學分析可以直觀展示種質材料特點，也是研究種質多樣性及開展作物育種工作的基礎，但需要較長的種植周期去觀察性狀間的差異，既費時費力，影響因素也較多。而基于物種DNA 序列的SSR（Simple Sequence Repeats）分子標記是一種技術成熟、應用廣泛的分子標記技術［5］，具有數量豐富、分布廣、穩定性好、等位基因多、共顯性遺傳等優點［6］，已全面應用于油菜［7］、水稻［8］、花生［9-10］、大豆［11］、大麥［12］等作物遺傳多樣性研究中。自2014 年辣椒基因組測序工作完成以來，在辣椒中開發SSR 分子標記變得更加便捷，SSR 分子標記在辣椒種質資源遺傳多樣性研究中也陸續得到應用［13-15］。Christov等［16］利用21 個SSR 分子標記對176 份1 年生辣椒種質材料進行遺傳多樣性分析，篩選出44 份材料并構建了一個迷你型核心種質庫。Gu等［17］利用29 個SSR 標記對我國蔬菜中期基因庫中的1 904 份辣椒種質資源進行遺傳多樣性分析，最終選擇248 份覆蓋75.6% SSR 等位基因的材料作為核心種質。Zhong等［18］利用33 個新開發的SSR 標記對來源于25 個國家的147 個灌木狀辣椒（C.frutescens）材料進行遺傳多樣性分析，并將其分為7 個大類群，聚類結果與材料來源具有一致性。【本研究切入點】相比國外的辣椒核心種質，我國辣椒資源的種間材料不夠豐富，但在種內存在一些特有的進化和分化情況。全方位了解和保存這些資源，可為辣椒種質資源進化馴化、特異基因挖掘和辣椒育種改良等研究奠定基礎。目前，國內外對辣椒種質資源同時進行疫病抗性評價和分子標記遺傳多樣性分析的研究還未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過辣椒全基因組篩選到20 個SSR 分子標記，對廣東省農業科學院蔬菜研究所辣椒課題組現存的96 份1 年生辣椒種質材料進行SSR 分子標記遺傳多樣性分析，同時對疫病抗性、熟性、果色、果型和果實風味5 個重要性狀進行調查，旨在加深對種質材料的了解并將核心種質材料加以保存，以應用于將來育種研究中。

1 材料與方法

1.1 供試辣椒材料及其重要性狀調查

96 份待測辣椒種質材料均由廣東省農業科學院蔬菜研究所辣椒課題組收集、創制的高世代純合種質材料。抗疫病對照CM334 和感疫病對照NMCA10399 均受贈于美國墨西哥州立大學Paul W.Bosland 教授［19］。96 份材料均在廣東省農業科學院鐘落潭實驗基地種植，進行常規化管理，并對其熟性、果色、果型和果實風味4 個重要性狀進行了初步調查和登記。熟性分為早熟、中熟和晚熟，其中始花節位10 節以下為早熟、10～14節為中熟、15 節及以上為晚熟；果色分為青熟果色和老熟果色，由肉眼觀察獲得；果型調查參照辣椒果實形態分類方法［20］，先測量果實橫徑和縱徑，再計算果型指數，進而判斷果型；果實風味定性分為甜、微辣、中辣、辣和極辣，由3 人同時生食品嘗鑒定獲得。

1.2 辣椒疫病抗性鑒評

1.2.1 待測辣椒苗培養 所有辣椒材料均播種于50 孔育苗盤中，每份材料播種25 孔，每孔播種3～5 粒種子，于植物培養室育苗。育苗基質為蛭石∶草炭∶土壤=1 ∶2 ∶1，高溫滅菌30 min 后備用，育苗條件為26（±2）℃的溫度下光照14 h、黑暗10 h 交替進行，濕度為70%，待幼苗長至6片真葉時用于接種。

1.2.2 供試菌株培養及孢子液制備 辣椒疫霉菌Byl4 為本實驗室分離獲得［21］，在固體V8 汁培養基上培養。培養基配制方法如下：200 mL V8 汁、3 g CaCO3和20 g 瓊脂，加水定容至1 000 mL，調節pH 至6.3，高溫滅菌30 min 后倒平板備用。將保存好的辣椒疫霉菌Byl4 接種于固體V8 汁培養基上，在恒溫箱中28 ℃黑暗條件下培養3～4 d 后轉移至室溫（26±2 ℃）下光照、黑暗各12 h 交替培養3～4 d。在培養皿中注入10 mL 無菌水，4 ℃放置30 min 后轉移到室溫（26±2 ℃）下放置30 min，誘導游動孢子釋放。采用無菌毛筆刷洗、2 層紗布過濾，獲得游動孢子懸浮液。采用血球計數板計數，調節濃度為1×104個/mL，備用。

1.2.3 接種及抗病性鑒評 接種前12 h 為待測辣椒植株充分澆水，使育苗基質水分達到飽和狀態。采用注射器吸取孢子懸浮液均勻注射于辣椒植株附近約1 cm 處，接種量為5 mL/孔。接種后于28 ℃黑暗條件下保濕培養24 h，而后在植物培養室參照育苗條件正常培育，至感病對照全部發病時（5 d 左右）調查待測苗發病表型。植株發病程度分為7 個等級，0、1 等級為無任何病癥，視為抗病植株；2、3、5、7、9 等級為具有不同程度病癥，視為發病植株［22］，統計發病株數，計算發病率〔發病率（%）=發病株數/總種植株數×100〕。植株抗性等級劃分參考Pecchioni 等方法分為5 個等級：無感病植株為免疫，0＜發病率≤5%為高抗，5%＜發病率≤20%為抗病，20%＜發病率≤50%為感病，發病率高于50%為高感［23］。

1.3 分子標記檢測

1.3.1 DNA 提取 采集6 片真葉期辣椒幼苗嫩葉，采用改良CTAB法［24］提取基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度，采用NanoDrop2000 測量DNA 濃度，并統一調整DNA濃度至60 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 分子標記篩選及分子標記檢測 在茄果類基因組數據庫網站（https://solgenomics.net/cview/map.pl?map_id=10）下載辣椒SSR 分子標記引物序列，送生工生物工程股份有限公司合成。選取表現型差異大的10 份辣椒DNA 樣品用于分子標記篩選，選出多態性好、條帶清晰且擴增穩定的SSR 標記用于后續遺傳多樣性分析。PCR 擴增體系為10 μL：2×TaqPCR MasterMix 5 μL、滅菌超純水2 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、模板DNA 2 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，60～55 ℃（每個循環降低1 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產物經8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

1.4 數據分析

整理并記錄所有條帶：先統計電泳圖等位基因，從上往下對等位基因數量進行統計；對于不同泳道（樣品）下的條帶，在相應等位基因上有條帶的記為“1”、沒有的記為“0”，由此獲得0～1 矩陣（每一行為一個泳道數據）。利用DataFormater 軟件［25］對數據進行格式轉換后，再利用Popgene32 軟件［26］進行等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）和Shannon 多樣性信息指數（I）等遺傳多樣性參數分析。另外，在統計軟件DPS［27］的遺傳聚類模塊下，基于Jiccard 方法將整理好的0～1 矩陣數據進行材料間的遺傳距離計算，得到遺傳距離矩陣，利用MEGA6.0 軟件［28］以類平均法（UPGMA）進行聚類分析，繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 辣椒種質材料重要性狀調查及疫病抗性鑒定

對96 份辣椒種質材料的熟性、果色、果型和果實風味4 個性狀的調查顯示，在熟性方面，早熟、中熟和遲熟辣椒材料分別有19、49 和28份；在果色方面，青熟果色為綠色、紅熟果色為紅色的辣椒材料占絕大多數，多達75 份；在果型方面，有57 份材料為圓錐形，牛角形、羊角形、燈籠形、螺絲形、線形和長柱形辣椒材料各有少量；在果實風味方面，中辣材料占比較多、有40份，極辣、辣、微辣和甜的材料分別有17、11、14 和14 份（表1）。疫病抗性鑒定結果顯示，96 份材料中，免疫材料有1 份，是國外引進的辣椒抗疫病資源；高抗材料有6 份，其中遲熟指天椒占3 份；抗病材料有24 份，占材料總數的25%；感病和高感材料分別有53 份和12 份，分別占材料總數的55%和13%，該調查數據與田間種植時疫病調查結果基本一致，只有編號10、28、45、54等4 份材料不一致，在田間均表現為抗病（表1）。

表1 96 份辣椒種質材料疫病抗性評價及重要性狀表型Table 1 Evaluation of Phytophthora disease resistance and phenotype of important traits of 96 pepper germplasm materials

2.2 SSR 分子標記篩選及分析

利用表現型差異較大的10 份辣椒材料，從102 對SSR 引物中篩選出20 對擴增穩定、條帶清晰且多態性豐富的引物組合（圖1）。20 個SSR標記較均勻地分布于辣椒12 條染色體上，除第10、12 染色體上沒有分布外，其他染色體上均有分布（表2）。

表2 20 對SSR 引物組信息Table 2 Information of 20 pairs of SSR primers

圖1 20 個SSR 分子標記擴增情況Fig.1 Amplification performance of 20 SSR molecular markers

以篩選出的20 對引物對96 份辣椒種質資源進行遺傳多樣性分析，20 對引物共檢測出79 個等位基因（Na）位點，每對引物檢測到的等位基因數為2～9 個、平均為3.95 個，檢測到的有效等位基因數（Ne）共48.0740 個、平均為2.4037 個；Shannon 多樣性信息指數（I）在0.2992～1.9893之間、平均值為0.9513，表明標記的遺傳多態性較高；檢測到的雜合度（Ho）在0～0.9792 之間，平均為0.1640；期望雜合度（He）在0.1622～0.8484之間，平均為0.5287；Nei’s 遺傳多樣性指數（H）在0.1614～0.8440 之間，平均為0.5259，表明材料間遺傳多樣性高（表3）。綜合分析顯示，篩選出的20 個SSR 分子標記多態性良好，能夠有效分析遺傳多樣性。

表3 20 個SSR 分子標記遺傳多樣性指數Table 3 Genetic diversity index of 20 SSR molecular markers

2.3 辣椒種質材料的聚類分析

基于Jaccard 方法進行遺傳距離計算，利用UPGMA 方法對96 份辣椒種質材料進行聚類分析，結果表明在遺傳距離0.37 處可以將供試材料分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3 個大類群。第Ⅰ大類群所含個體數最少、僅3份，均是從美國引進的辣椒種質材料，其中編號78、79 的材料分別是已育成辣椒新品種金田1 號的父母本。第Ⅱ大類群包含14 份材料，其中編號74、75 兩份材料極其相似，遺傳距離僅為0.0062，兩者應該是同一份材料的不同株系；在這14 份材料中，各有4 份材料是指天椒（編號74、75、80 和81）和甜椒（編號6、71、72 和73）類型，即這兩類果型、果實風味等性狀表現出極大差異的材料聚在一起。第Ⅲ大類群所含個體數最多、共有79 份材料，在遺傳距離0.32 處又可將第Ⅲ大類群分為Ⅲa、Ⅲb 和Ⅲc 等3 個亞類群，3 個亞類群分別包含有16、12 和51 份材料。在Ⅲa 亞類群中，編號65 和68 兩份材料的遺傳距離極小、僅為0.0054；Ⅲb 亞類群中，編號87 和92 兩份材料的遺傳距離也僅為0.0081；在Ⅲc 亞類群中，編號69 和70，12 和49，1 和11，17 和45，以及3、25、32、36、39、40、43和44 這5 組材料的遺傳距離均接近于0（圖2），推測以上7 組材料均來源于同一材料的不同株系。

圖2 96 份辣椒種質材料的遺傳多樣性聚類分析Fig.2 Cluster analysis of genetic diversity of 96 pepper germplasm materials

3 討論

種質資源是遺傳育種的基礎，為應對當前全球氣候變化帶來的挑戰以及人們對農產品數量需求的增加和品質要求的不斷提高，收集豐富的作物種質資源并建立資源庫是極為重要的一項工作。然而，數量龐大的作物種質資源在保護和管理實踐中均面臨著問題，因此，建立一個核心基因庫，在保留作物種質基因多樣性的同時盡可能去除重復或是遺傳關系相近的種質資源是一條有效途徑。前人或基于表型數據、或基于基因型數據或是將以上兩者結合起來，構建了核心種質庫［29-31］。Gu等［17］利用29 對SSR 標記對我國蔬菜中期基因庫中的1 904 份辣椒種質資源進行遺傳多樣性分析，最終選擇248 份覆蓋75.6% SSR等位基因的材料作為核心種質。Christov等［13］基于21 個SSR 標記對176 份一年生辣椒種質進行

遺傳多樣性分析，并最終選出44 份核心材料構建了一個迷你型核心基因庫。本研究通過從辣椒基因組上的102 個SSR 分子標記中篩選出20 個擴增穩定、條帶清晰且多態性豐富的標記對96 份辣椒資源進行分析，結果顯示這20 個篩選出來的分子標記遺傳多態性較高，可以用于辣椒種質材料的遺傳多樣性分析。此外，分析結果還發現，材料74 和75，65 和68，87 和92，69 和70，12和49，1 和11，17 和45，以及3、25、32、36、39、40、43和44這8組材料的遺傳距離均接近于0，表明它們之間親緣關系極近，在種質保存時每組只保留其中一份即可。盡管如此，96 份辣椒種質材料的平均Nei’s 遺傳多樣性指數為0.5259，表明材料間遺傳多樣性高，具有應用于雜交育種的前景。

常見的辣椒疫病接種鑒定方法有離體葉片接種法、切莖接種法和游動孢子液灌根接種法，以上3 種方法各有優缺點，但灌根接種法因更接近于辣椒疫病在田間的發生過程，因此更接近于辣椒材料的真實抗性水平［32-33］，也最為常用。2011 年開始實施的行業標準《辣椒抗疫病鑒定技術規程》（批準號：NY/T 2060.1-2011，下稱“標準”）規定，接種前需用玻棒在距幼苗根莖約3 cm 處扎一孔，孔深3 cm 左右［34］，且表型鑒定采用分級，分別為0～5 級：0 級為無任何癥狀；1 級為幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；2級為幼苗根莖部變黑達1～2 cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；3 級為幼苗根莖部變黑超過1～2 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；4 級為幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫；5 級為植株枯死。鑒定過程操作越繁瑣，通常越容易帶來誤差，如《標準》規定的“在距幼苗根莖約3 cm 處扎一孔”，以加快侵染速度的目的，完全可以通過增大疫霉菌游動孢子液濃度來達到。另外，由于表型分級帶有“稍有”“偶有”等描述模糊的詞語，同時一個級別有好幾個病癥共存，造成表型鑒定復雜化且主觀性太強，影響表型鑒定的準確性。因此，本研究在對96 份辣椒種質材料進行疫病鑒定時采用的是改良后的灌根接種法。一是加大接種液孢子總量，即由標準規定的3×103增加到5×104的量，該接種量也是通過本團隊長期摸索得出并沿用至今［21,35-37］。表型調查中植株表型分為兩種，即分為無任何癥狀的正常植株和有不同程度病癥的發病植株［22］，將表型調查簡化，如此盡可能減少實驗誤差，使疫病鑒定結果更接近于材料本身的真實水平。

4 結論

通過辣椒全基因組掃描篩選到20 個SSR 標記，對96 個辣椒種質材料進行了遺傳多樣性分析，20 個SSR 標記的Shannon 信息指數平均值為0.9513，表明所選用的20 個SSR 分子標記遺傳多態性較高，能夠用于遺傳多樣性分析；Nei’s 遺傳多樣性指數平均值為0.5259，表明材料間遺傳多樣性高，但聚類分析顯示有8 組材料間的遺傳距離接近為0，即親緣關系極近。因此，綜合表明這96 份辣椒種質材料來源豐富，但存在同質材料，在種質保存時可以適當舍棄部分材料。另外，改良后的辣椒疫病灌根鑒定方法鑒評結果與材料在田間表現基本一致，可以用于辣椒疫病抗性評價。