自噬紊亂促進膿毒癥免疫抑制機制的研究進展

余澤偉 孫 健

1.紹興文理學院醫學院，浙江紹興 312000；2.紹興文理學院附屬第一醫院呼吸內科，浙江紹興 312000

膿毒癥致急性器官功能障礙居重癥監護病房患者死亡原因的首位，其起病急驟且發展迅猛，具有發病率高、治療費用昂貴、病死率高等特點，顯著增加全球疾病負擔，因此，2017 年世界衛生組織將膿毒癥列為全球衛生優先事項[1]。膿毒癥的發病機制尚未明確，目前研究顯示，免疫抑制誘發的頑固性感染是導致膿毒癥高病死率的根本原因。此外，膿毒癥具有高度異質性，且臨床治療變異性高，目前僅依靠抗生素、液體復蘇和器官支持治療，尚難以降低患者中遠期病死率。因此，進一步探索膿毒癥免疫抑制的機制，尋找更有效、更精準的治療方法，有著極其重要的現實意義。

細胞自噬是真核生物對自身細胞內廢棄的細胞器、侵犯的微生物等，通過溶酶體機制進行降解、再循環的過程，其同時參與免疫應答、炎癥反應及細胞增殖等多種重要的生理過程，維持內環境穩態，常常被認為是一種細胞保護性程序[2]。自噬還具有恢復免疫細胞功能的潛力[3]。研究顯示，膿毒癥晚期自噬功能紊亂可能是導致膿毒癥引發免疫抑制的主要原因[4]。因此，進一步探索自噬在膿毒癥晚期免疫抑制中的作用機制，可能成為治療膿毒癥的新靶點之一。

1 膿毒癥與宿主免疫

新的膿毒癥指南定義，膿毒癥是因感染引發的宿主本身免疫功能失調而導致多器官功能衰竭，該定義將感染、免疫功能失調、多器官功能衰竭聯系在一起，強調三者之間的遞進關系，其中膿毒癥的主要環節為宿主免疫反應失調[5]。

1.1 膿毒癥的病程與機體免疫狀態的關系

當機體處于各種內源性或外源性應激時，會觸發一系列的免疫應答反應[6]。研究表明，宿主可通過模式識別受體（pattern–recognition receptor，PRR）識別各種有害抗原，啟動一系列下游信號分子，刺激免疫細胞釋放大量白細胞介素（interleukin，IL）–1β、腫瘤壞死因子–α（tumor necrosis factor–alpha，TNF–α）等炎癥介質。同時，抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）通過PRR 識別外源性抗原，與APC 表面表達的主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）結合形成抗原肽–MHCⅡ復合體，協同共刺激分子一起呈遞給CD4+T 淋巴細胞，使其活化并釋放更多細胞因子形成“炎癥細胞因子風暴”，致使炎癥擴散及組織損傷，并最終引發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）；隨后，促炎反應激活調節性T 細胞（regulatory T cell，Tr 細胞），釋放轉化生長因子–β（transforming growth factor–beta，TGF–β）、IL–10，及髓系來源抑制細胞（myeloid–derived suppressor cell，MDSC）[7]、兒茶酚胺[8]等抑制CD4+和CD8+T 淋巴細胞功能。隨即細胞凋亡相關信號通路被激活，淋巴細胞群相繼凋亡，且可降低單核細胞表面人類白細胞抗原–DR（human leukocyte antigen–DR，HLA–DR）的表達[9]，誘發免疫麻痹[10]，引發代償性抗炎反應綜合征（compensatory anti–inflammatory response syndrome,CARS）。

早期研究認為SIRS 與CARS 是膿毒癥序貫出現的兩個階段，但隨著深入研究膿毒癥相關機制，發現SIRS 和CARS 并不是兩個獨立體，二者互相影響，或稱混合性拮抗炎癥反應綜合征（mixed antagonist response syndrome，MARS）。Xiao 等[11]研究顯示，全身性感染免疫抑制在早期即可發生。近年來，隨著重癥醫學的進步，尤其是早期目標指導性治療和早期集束化治療的提出規范了膿毒癥的治療行為[12]，使膿毒癥患者的早期病死率下降52.8%[13]。然而臨床發現，更多在早期炎癥反應亢進中幸存的膿毒癥患者出現病情遷延，部分患者長期滯留重癥監護病房而大量消耗醫療資源。最近研究顯示，即使膿毒癥幸存者達到臨床治愈后出院，當再次給予免疫系統激活劑刺激時，其細胞因子分泌能力大大減弱，顯示免疫系統受到全面損害[14]，其2～3 年內病死率高達45%～71%[15,16]。Gentile 等[17]因此提出持續炎癥反應–免疫抑制–分解代謝綜合征（persistent inflammatory response immunosupp–ressive catabolism syndrome,PICS）這個新概念。

1.2 PICS 炎癥–免疫–代謝多重惡性循環

PICS 是指慢性危重癥患者因受到全身嚴重感染或非感染如重癥急性胰腺炎等打擊而表現為持續的慢性炎癥反應、免疫功能抑制及代謝功能紊亂，其突出的特征是持續炎癥反應亢進和免疫功能抑制同時并存[17]。

PICS 患者因持續的感染灶或難以愈合的損傷，通過各種炎癥細胞通路誘發促炎反應，觸發“炎癥細胞因子風暴”，引發急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS），隨著免疫細胞的大量消耗及凋亡，最終導致免疫麻痹，形成炎癥–免疫惡性循環。最近有研究者提出膿毒癥后死亡的三峰分布[18]：①免疫亢進導致的早期死亡；②持續性器官損傷和免疫抑制導致的延遲死亡[9]；③持續的免疫功能障礙和慢性炎癥導致的遠期死亡[19,20]?？梢?，由感染、創傷等原因誘導的宿主免疫功能抑制可能是導致膿毒癥中遠期病死率增加的根本原因。

膿毒癥的高代謝反應主要通過增強糖酵解途徑及氧化磷酸化產生的腺苷三磷酸（adenosine–triphosphate，ATP）供能[21]。長期高分解代謝致營養不良，引起能量代謝失衡，通過免疫代謝機制使免疫功能降低，誘發機會性感染；同時免疫細胞的代謝缺陷將導致紊亂的炎癥反應，最終引發免疫麻痹，形成炎癥–免疫–代謝多重惡性循環[22]。

1.3 膿毒癥機體免疫狀態的監測

膿毒癥早期，盡管固有免疫激活、炎癥亢進和免疫抑制可同時存在，但仍以免疫亢進為主，隨著病程的進展，在持續多重惡性循環下，晚期通常以免疫抑制占主導地位，這提示膿毒癥患者免疫狀態存在時間轉折點，動態監測其變化可能成為靶向免疫監測及免疫調理治療的重要手段，但目前臨床上仍缺乏明確的免疫監測指標。

HLA–DR 是公認的免疫抑制相關的生物標志物。研究表明，重癥膿毒癥死亡患者外周血單核細胞HLA–DR 表達明顯下降[9]，呈典型的免疫抑制狀態，提示HLA–DR 可用于監測機體免疫功能，且HLA–DR 表達低下與膿毒癥患者不良預后有顯著相關性[23]。Meisel 等[24]將連續 2d 表達單核細胞HLA–DR＜每細胞8000 單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAb）設定為免疫抑制組，用免疫增強藥物粒細胞–巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte–macrophage colony–stimulating factor，GM–CSF）治療膿毒癥免疫抑制患者，并將單核細胞HLA–DR≥15 000mAb 作為治療指標。相關研究發現，院內金黃色葡萄球菌感染患者多合并基礎疾病等，宿主免疫功能已受損，此時免疫炎癥細胞中的基因轉錄悄然改變，當機體再次受到刺激時，大量免疫抑制因子（如IL–10）釋放，相反，機體分泌促炎因子的能力降低甚至無反應，表現為IL–10/TNF–α 比值升高，誘導并加重機體免疫抑制，該過程稱為內毒素耐受[25]。免疫細胞的增殖狀態是另一個反映機體免疫狀態的指標[26]，目前已有研究報道將外周血總淋巴細胞計數＜0.8×109/L 作為判斷免疫功能抑制的標準[15]。提示機體的免疫水平可通過動態監測血漿細胞因子（如IL–10/TNF–α 比值）、HLA–DR 表達及免疫細胞增殖進行評估。

2 細胞自噬在膿毒癥晚期免疫抑制中的作用

2.1 自噬對膿毒癥患者組織器官的作用

自噬能促進生成微管運輸相關蛋白和溶酶體相關蛋白，還能抑制IL–18、IL–1β 及氧自由基等的產生，經PRR/吞噬體/溶酶體途徑實現細胞內清除，達到減輕炎癥反應、保護組織器官的作用[4]。Zhao 等[27]研究顯示，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）能夠誘導自噬，減少炎癥細胞活化和增殖，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠膿毒癥ALI。Sun 等[28]研究發現，心臟自噬相關蛋白Beclin–1 依賴性自噬，可緩解LPS誘導的膿毒癥相關損傷，改善心臟功能。Hsiao 等[29]通過盲腸結扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）制作膿毒癥模型，發現腎小管上皮細胞自噬在術后3h逐漸升高，并在9～18h 呈下降趨勢，當應用mTOR抑制劑刺激NRK–52E 細胞10h，發現其LC3Ⅱ（自噬相關蛋白）明顯升高，且細胞死亡的數目減少。但也有研究發現，抑制自噬反而減輕LPS 誘導的ALI[30]?？梢?，膿毒癥引發多臟器功能衰竭的器官中細胞自噬上調，但在不同器官和疾病的不同病程，自噬可能呈現不同的調節作用，以維持促炎和抗炎因子間的穩態平衡[31]。

2.2 自噬影響膿毒癥晚期機體免疫狀態

膿毒癥晚期患者通常以免疫抑制為主，表現為HLA–DR 和協同刺激分子表達降低，MHCⅡ分子抗原呈遞能力下降，產生促炎細胞因子的能力下降，呈現免疫麻痹。自噬可促進樹突狀細胞、B 細胞和上皮細胞的生成，上調HLA–DR 的表達，增強固有免疫；LC3Ⅱ可使CD4+T 淋巴細胞表達HLA–DR 增多，增強機體的獲得性免疫。簡言之，自噬能增強MHCⅡ分子抗原呈遞并活化CD4+T 淋巴細胞[32]。Kondylis 等[33]研究提示，自噬可能是通過與內體MHCⅡ類區室（MHC class Ⅱ compartment，MⅡC）融合來協助其發揮抗原呈遞功能。自噬還可促進MHCⅠ類分子交叉遞呈細胞外抗原，但機制尚不明確[34]。

2.3 自噬參與調節免疫細胞增殖并維持免疫穩態

mTOR 是磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3–kinase，PI3K）相關激酶家族成員之一。細胞自噬受上游信號分子mTOR 的負性調控，且可通過PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR 或腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’–monophosphate–activated protein kinase，AMPK）/mTOR 信號通路抑制mTOR以實現上調自噬[19]。同時，mTOR 也調控免疫細胞的分化和增殖，在細胞的生存中不可或缺[35]。

研究發現，LPS 能激活磷酸化的mTOR（phos phorylation–mTOR，p–mTOR），促進THP–1 細胞增殖，表現為典型的膿毒癥早期炎癥反應。LPS 還能刺激THP–1 細胞通過核因子–κB 抑制蛋白激酶（nuclear factor–kappa B inhibitor protein kinas，IKK）/核因子–κB（nuclear factor kappa B，NF–κB）/TNF–α途徑引發炎癥并誘導自噬。當給予自噬誘導劑米諾環素后，能明顯抑制p–mTOR 并誘導自噬，抑制細胞增殖并減少細胞因子的分泌，且與mTOR 抑制劑有協同作用，提示早期給予自噬誘導劑能夠抑制炎癥[36]。在膿毒癥腦病中，抑制NF–κB 信號通路可推動自噬流，促進神經細胞修復[37]；積聚的p62（自噬相關蛋白）可抑制自噬流激活NF–κB 加劇炎癥因子風暴[38]。意味著NF–κB 和自噬這兩個應激途徑在炎癥反應及免疫反應中呈現密切的相互作用。

如前所述，激活mTOR 能促進免疫細胞快速增殖，但此時自噬反而受到抑制。由于自噬對調節記憶性免疫細胞的功能至關重要，因此，靶向自噬的治療可能對維持機體免疫平衡有著重要意義[39]。

2.4 自噬與膿毒癥免疫抑制期T 淋巴細胞的關系

T 淋巴細胞是機體獲得性免疫的關鍵成員，廣泛參與機體的免疫應答反應，T 淋巴細胞亞群通常反映機體的免疫水平，其中輔助T 細胞（helper T cell，Th 細胞）是介導細胞免疫的重要成員，包括Thl 細胞和Th2 細胞。Thl 細胞分泌的γ 干擾素（interferon–gamma，IFN–γ）、TNF–α 具有刺激自噬的作用，Th2細胞分泌的IL–4 和IL–13 能抑制自噬[40]。

隨著膿毒癥病程進展，單核/巨噬細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞凋亡增加。此外，T 淋巴細胞長期暴露于持久性刺激中可能會致其表面抑制受體的表達增加[41]，CD4+和CD8+T 淋巴細胞產生減少，誘導Th1 細胞向Th2 細胞極化，分泌IFN–γ、TNF–α等細胞因子的能力減弱，細胞增殖能力受損，HLA–DR 表達下降，Tr 細胞及TGF–β 增加，巨噬細胞、單核細胞等還會分泌大量IL–10、IL–4，一同誘發免疫抑制[42]。

免疫功能障礙的關鍵因素是T 淋巴細胞耗竭，而T 淋巴細胞耗竭的主要原因為細胞凋亡。自噬與凋亡存在廣泛串擾，如B 細胞淋巴瘤2 家族蛋白可通過與Beclin–1 直接結合來限制其功能[43]。

Lin 等[44]研究發現，在T 淋巴細胞特異性自噬相關基因7（autophagy associated gene7，Atg7）敲除小鼠中建立CLP 誘發膿毒癥，會使CD4+和CD8+T 淋巴細胞中自噬蛋白減少，同時增加CD4+和CD8+T 淋巴細胞凋亡及小鼠病死率。Oami 等[4]研究顯示，當自噬流受到抑制時，能增加程序性死亡蛋白–1（programmed death，PD–1）的基因表達，加速T淋巴細胞凋亡，導致T 淋巴細胞活力和功能下降，從而增加病死率。Ge 等[45]研究顯示，在通過CLP 和內毒素刺激方法誘導的膿毒癥小鼠模型中，IL–36 通過激活自噬降低CD4+、CD25+Tr 細胞的免疫抑制活性。Wang 等[46]研究揭示mTOR 基因敲除的CLP 小鼠表達更高的LC3Ⅱ/Ⅰ、更低的p62 并減少CD4+T淋巴細胞凋亡，這表明mTOR 的缺失通過改善自噬流來緩解CD4+T 淋巴細胞凋亡。膿毒癥免疫抑制期機體上調自噬的能力是有限的[28]，當外源性有害因素持續存在時，將導致自噬活性降低并引發細胞自噬性死亡[47,48]。綜上所述，自噬的缺乏或受抑制與免疫細胞凋亡及其功能障礙的發生有著密不可分的聯系，上調自噬能減輕免疫抑制，提示膿毒癥晚期免疫抑制時誘導自噬有可能恢復免疫功能。

3 展望

膿毒癥的疾病進程復雜，異質性強，但治療針對性差，預后常不佳。PICS 的提出讓越來越多的研究者意識到，單純的抗炎或免疫治療可能并不適宜。自噬影響膿毒癥患者的免疫狀態，在膿毒癥晚期誘導自噬可能恢復免疫細胞功能。因此，推測在免疫監測下進行個體化自噬調節聯合免疫調理，較傳統的治療方式更有利于對膿毒癥晚期患者開展精準治療。