ACL的構建及其對結直腸癌HCT116細胞增殖和遷移的作用

劉曉敏， 朱雯婷， 李玉婷， 賈夢磊， 嚴鵬科

(廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣東省廣州市510145)

結直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大原因[1]。結直腸癌的發生與發展是一個多階段、多要素的病理過程，其發病原因復雜，至今尚不完全明確。阿托伐他汀鈣(atorvastatin calcium,AC)是他汀類藥物，除降脂作用外，也具有一定抗結直腸癌的作用[2-3]。盡管阿托伐他汀鈣具有良好的體外抗腫瘤作用，但其細胞抑制所需劑量遠高于臨床治療劑量，導致臨床上需要給予較高劑量AC才可達到相同的抗腫瘤效果[4]。而口服AC首次代謝效應高，生物利用度低，水溶性差，限制了其臨床應用[5]。脂質體作為藥物載體具有改善疏水藥物的水溶性、延長藥物釋放時間、提高藥物在體內的穩定性和改善體內藥物分布等優點[6]。本文構建了阿托伐他汀鈣脂質體(atorvastatin calcium liposome,ACL)，并研究ACL對結直腸癌HCT116細胞增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

阿托伐他汀鈣、膽固醇、大豆卵磷脂(大連美侖生物技術有限公司)；HCT116細胞(武漢普諾賽生物科技有限公司)；三氯甲烷(西隴科學股份有限公司)；0.22 μm微孔過濾器(Millipore公司)；香豆素6(大連美侖生物技術有限公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)；1%結晶紫染料(北京雷根生物技術有限公司)；高糖DMEM培養基(康寧公司)；血清(上海ExCell公司)；Transwell(美國BD公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90粒徑儀(英國Malvern公司)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；紫外分光光度計(日本島津公司UV-1780)；酶標儀(美國BioTek公司Elx808)；倒置顯微鏡(日本尼康公司)；共聚焦顯微鏡(日本尼康公司A1)。

1.2 ACL的制備

采用乳化-溶劑揮發法制備ACL[7]。稱取180 mg大豆卵磷脂，20 mg膽固醇，20 mg AC加至2 mL三氯甲烷中溶解，將油相逐滴滴入攪拌的25 mL去離子水中，攪拌速度450 r/min，溫度25 ℃，連續攪拌1.5 h。用細胞超聲破碎儀，功率150 W，超聲50次，每次3 s，通過0.22 μm濾膜過濾除去未包載的AC，得到ACL。以香豆素6(coumarin-6,Cou-6)為熒光探針探究HCT116細胞對藥物的攝?。徊捎孟嗤姆椒ㄖ苽湎愣顾?脂質體(Cou-6/Lps)。

1.3 ACL的表征觀察

Zetasizer Nano ZS90粒徑儀測定ACL的平均粒徑和Zeta電位。采用光散射法測量粒徑，采用強度分布對數據進行評估。Zeta電位在25 ℃下分析。在透射電子顯微鏡下觀察ACL的形態。適當稀釋脂質體溶液，吸取適當脂質體溶液于碳網上，靜置5 min，用2%磷鎢酸(PTA)染色5 min，濾紙吸收多余溶液，自然干燥，觀察其表面形態和分布情況。采用紫外分光光度計測定ACL在246 nm波長下的光密度，計算ACL的包封率(EE)和載藥率(DL)。EE(%)=截留藥量/總給藥量×100%；DL(%)=截留藥量/(總給藥量+膜材質量)×100%[8]。

1.4 ACL的穩定性實驗

收集4 ℃或25 ℃下不同時間(0、4、8、12、24、48、72、96、120 h)ACL，加入甲醇稀釋脂質體使脂質體破裂，藥物釋放，紫外分光光度計測定246 nm波長下光密度，依據AC標準方程計算藥物質量濃度。

1.5 細胞培養及分組

HCT116細胞在含10% FBS的高糖DMEM培養基中培養，條件為37 ℃、5%CO2。將實驗分為陰性對照組(Control組)、阿托伐他汀鈣組(AC組)、阿托伐他汀鈣脂質體組(ACL組)。Control組細胞不進行處理；AC組、ACL組分別用2.5 mg/L AC、ACL干預[9]。

1.6 HCT116細胞攝取實驗

應用共聚焦顯微鏡，將HCT116細胞5×104個/孔接種于共聚焦小皿上。次日，分別與無血清培養基配制的10 mg/L Cou-6/Lps和Cou-6共孵育1、2 h。結束后，PBS洗凈，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min。用PBS徹底清洗共聚焦小皿，DAPI避光處理2 min，PBS封片，并在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 MTT法

HCT116細胞以5×103個細胞/孔接種于96孔板中，培養箱孵育過夜。分別加入不同質量濃度(0.3、0.6、1.3、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L)ACL或AC，48 h后加入100 μL MTT溶液(0.5 g/L)，培養箱孵育4 h。移去上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，低速震蕩10 min。使用酶標儀在490 nm處測量光密度(OD)。細胞增殖率(%)=藥物處理組OD/空白組OD×100%。

1.8 細胞平板克隆實驗

HCT116細胞以1×103個/孔接種于6孔板中，培養箱孵育過夜，分別加入ACL或AC。每隔兩天進行換液，直至細胞形成一定體積的克隆球。棄去原有培養基，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定15 min，加入1%結晶紫染色30 min，水洗去除多余染料，晾干并進行拍照，采用Image J軟件處理圖片。

1.9 Transwell實驗檢測細胞遷移

HCT116細胞以1×105個/孔接種于Transwell內室中，分別加入ACL或AC，放置于含有700 μL 10%FBS培養基的24孔板中孵育。24 h后，移去小室內液體，4%多聚甲醛固定15 min，用棉簽擦拭內室細胞，1%結晶紫染色30 min，水洗除去多余染料。采用倒置顯微鏡觀察遷移的細胞并拍照。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 ACL的表征及穩定性

ACL平均粒徑(87.24±0.485) nm，分散系數0.240～0.250，Zeta電位(-12.19±3.642) mV。透射電鏡觀察到脂質體形態似球形或圓形結構，外觀完整，且大小均勻，粒徑與粒度儀檢測粒徑相近(圖1A、B、C)。ACL包封率為97.47%±0.35%，載藥率為8.8%±3.8%，具有較高的包封率和載藥率。

在不同溫度下，隨著時間的延長，藥物質量濃度剛開始下降較大，但后續并沒有很大的改變，ACL具有較好的穩定性(圖1D)。

2.2 脂質體納米載藥系統增加HCT116細胞攝取

在1、2 h時，與Cou-6相比，Cou-6/Lps組細胞內熒光強度明顯增強，細胞攝取明顯增多，提示脂質體納米載藥系統可以顯著增強細胞對藥物的攝取，增加細胞內藥物質量濃度(圖2)。

圖2 脂質體納米載藥系統增加HCT116細胞攝取(熒光染色，800×)

2.3 ACL抑制HCT116細胞增殖

ACL組和AC組細胞增殖率呈劑量依賴性下降，且ACL的抑制作用明顯強于AC(圖3)。

圖3 ACL和AC對HCT116細胞增殖的影響

2.4 ACL抑制HCT116細胞克隆形成與遷移

與Control組比較，ACL組、AC組克隆形成率均降低，且ACL組低于AC組(P<0.01)；與Control組比較，AC組、ACL組細胞遷移數顯著減少(P<0.01)，且ACL組細胞遷移數明顯少于AC組(P<0.05；圖4)。

3 討 論

Cai等[10]研究發現，AC抑制結腸癌細胞增殖并促進其凋亡。AC和根皮素通過協同誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期聯合抑制結腸癌細胞的生長[11]。但因AC臨床劑量及水溶性低等特點，臨床應用前景不佳。脂質體具有生物膜相似結構、良好的生物相容性等特性，作為遞送系統在藥物開發中越來越有吸引力[12-13]。Liu等[14]將紫杉醇和阿霉素共同包載在單個交聯多層脂質體囊泡中，極大地增加了兩個藥物的包載率和緩釋效果，提高了藥物聯用效果。Kim等[15]將利妥昔單抗封裝在脂質體內部，然后在腫瘤部位釋放可以顯著增強腫瘤細胞的消融。上述結果表明脂質體為抗腫瘤藥物提供了一種有效的藥物遞送系統。

本研究制備了ACL，通過對其粒徑、Zeta電位、穩定性和形態等表征的測定，發現脂質體具有較小的粒徑，<200 nm的脂質體可以被動靶向至腫瘤部位[16]。本課題組前期研究發現，與游離DiR相比，DiR脂質體可以顯著增加DiR在腫瘤部位的富集[17]。脂質體包載后，脂質體通過吞噬作用或內吞作用等方式進入細胞，且藥物被包載后具有緩釋效果，會持續釋放藥物，延長藥物作用時間，增加細胞內的藥物水平，從而起到增強療效的作用[16,18]。

本研究選用人結腸癌HCT116細胞株，其具有惡性程度高、增殖旺盛、傳代迅速、侵襲能力強等特點，適合結直腸癌體外研究，是結直腸癌體外研究常用的模式細胞[19]。本研究發現脂質體可以增強AC對結腸癌HCT116細胞的抗腫瘤作用。結果表明，相較于陰性對照組，AC組和ACL組均可以顯著抑制HCT116細胞的增殖及遷移，且ACL組的抑制效果更佳。這可能是AC被脂質體包載后顯著提高細胞內藥物水平，進而能增強其對HCT116細胞增殖與遷移的抑制作用。

脂質體作為抗腫瘤藥物載體，具有提高藥物被癌細胞的攝取，增加療效、降低正常組織不良反應等優點。但是，脂質體存在易被巨噬細胞清除、靶向性不高等缺點[20]。因此，后續研究中在脂質體上修飾一些常用的靶向分子制備特殊性環境以進一步增強ACL的抗腫瘤效果。

綜上所述，阿托伐他汀鈣脂質體包載后顯著抑制HCT116細胞的增殖與遷移，從而增加阿托伐他汀鈣的抗結腸癌作用。