抑制IL-17A表達對膿毒血癥小鼠急性腎臟損傷的影響

陳俊, 李勇, 何明龍

(南充市中心醫院急診科，四川省南充市 637000)

膿毒血癥是機體在感染等因素作用下的不可逆轉和不可控的全身炎癥反應[1-2]。膿毒血癥進展快且病情危重，導致其病死率極高，目前已經是重癥監護室最常見的死亡原因之一[3-4]。在全身嚴重的炎癥反應作用下，膿毒血癥容易導致多器官功能衰竭，而腎臟是常受累的器官[5-6]。據統計，近年膿毒血癥急性腎損傷的發病率逐漸上升，且有年輕化的趨勢，嚴重危害了人們的生命健康。然而，目前尚無有效的策略治療膿毒血癥急性腎損傷。因此，進一步探究膿毒血癥急性腎損傷的機制以及有效的治療策略是急需解決的科學問題。

白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)是機體重要的細胞因子，其具有促進中性粒細胞遷移和誘導細胞因子和趨化因子表達的作用[7-8]。研究顯示，IL-17A廣泛參與機體的各種細胞活動，包括自身免疫、炎癥、腫瘤和感染[9]。在人類敗血癥中，血液及組織的IL-17A水平是升高的[10]。部分學者將IL-17A作為多發性創傷敗血癥患者轉入重癥監護室的評估指標[11]。本文就IL-17A的表達對膿毒血癥小鼠急性腎臟損傷的影響報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

IL-17A抑制劑(SGC-CBP30)和脂多糖購自美國MCE公司。HE染色試劑盒和油紅染色試劑盒由索萊寶公司提供；廣譜的蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物和BCA試劑盒購自碧云天生物有限公司；IL-17A和白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自美國Abcam公司。TUNEL染色試劑盒購自于羅氏公司。

1.2 實驗動物及處理

8周齡雄性Balb/c小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，體質量(22.0±1.1)g。小鼠飼養環境溫度按照國際嚙齒類動物飼養標準執行。24只小鼠按照隨機數字表法均分為對照組、模型組和抑制劑組。模型組和抑制劑組小鼠腹腔注射高劑量LPS(10 mg/kg)建立膿毒血癥急性腎損傷模型。抑制劑組0.5 h內給與IL-17A抑制劑腹腔注射(30 mg/kg)，然后每12 h處理1次，共6次。IL-17A抑制劑的半衰期是24 h，半數致死量200 mg/kg，本研究給藥策略是根據半衰期確定的。模型組和對照組小鼠在相同時間點僅給與等量生理鹽水注射。

1.3 腎臟炎癥因子、血清肌酐和尿素氮的測定

收集小鼠腎臟，經液氮磨碎后，加入RIPA及蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物，ELISA法檢測腎臟IL-17A、IL-6和TNF-α含量。收集小鼠血液，低溫離心后吸取血清，ELISA法檢測血清肌酐、尿素氮及炎癥因子含量。具體步驟詳見說明書。

1.4 HE染色

收集小鼠腎臟，經多聚甲醛固定后，用乙醇梯度脫水，石蠟5 μm切片，經脫蠟脫水后，進行HE染色。具體步驟為：蘇木素染色5 min，5%乙酸分化1 min，再返藍液處理30 s，伊紅染色1 min，70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，再經二甲苯透明后封片，顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學測定

取腎臟切片，經脫蠟后，進行抗原修復，再經3%過氧化氫0.5%Triton溶液處理15 min，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗后，再經3%牛血清白蛋白封閉30 min，再分別加入Caspase 3抗體，在4 ℃冰箱過夜，次日加入相應來源HRP標記的二抗，最后經DAB顯色、乙醇脫水后封片。

1.6 腎臟損傷評分

取腎臟切片，按照過碘酸雪夫染色液說明書做糖原染色(PAS染色)。然后在光鏡下觀察評估50個腎小管。腎臟損害程度標準估計:0分為正常；1分為腎小管損害少于25%；2分為腎小管損害25%～50%；3分為腎小管損害50%～75%；4分為腎小管損害75%～100%[12]。

1.7 免疫蛋白印跡檢測Caspase 3、Bax水平

分別收集小鼠主動脈，經液氮磨碎后，加入100 μL RIPA及蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物，裂解細胞，然后用BCA法測蛋白水平后，加入SDS蛋白上樣緩沖液配平分裝。再取20 μg蛋白樣品加入4%～20%預制膠，電泳，轉膜，將NC膜移至含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗：Caspase 3、Bax(1∶500)以及β-actin(1∶2 000)，將NC膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。用TBST充分洗滌NC膜3次，每次約5 min，然后用血清稀釋免疫熒光二抗(1∶5 000)，使NC膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育1 h；TBST充分洗去多余二抗，用Odyssey曝光儀檢測，用Image J分析灰度值。

1.8 TUNEL染色檢測凋亡細胞

取腎臟切片，經脫蠟后，然后按照TUNEL染色試劑盒步驟染色，1 μL rTdT+1 μL生物素標記的dUTP+98 μL平衡液混勻后加入標本上，在暗濕盒中反應37 ℃×1 h，終止反應后用磷酸鹽緩沖液清洗，加入POD后再用DAB顯色，清洗脫水后封片。

1.9 統計分析

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理和統計學分析，計量資料采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗,P<0.05則認為差異有統計學意義。

2 結 果2.1 各組腎臟IL-17A、IL-6和TNF-α水平的比較

腎臟IL-17A、IL-6和TNF-α水平模型組高于對照組，抑制劑組低于模型組(P<0.05；圖1)。

圖1 各組腎臟IL-17A、IL-6、TNF-α水平的比較

2.2 各組腎臟損傷情況的比較

HE染色結果顯示，模型組小鼠腎臟嚴重損傷，而IL-17A抑制劑處理能改善腎臟損傷。此外，糖原染色結果顯示，腎臟損傷評分模型組高于對照組，抑制劑組低于模型組(P<0.05；圖2)。

圖2 各組腎臟損傷情況的比較

2.3 各組血清肌酐、尿素氮、炎癥因子的比較

小鼠血清肌酐和尿素氮水平模型組高于對照組，而抑制劑組低于模型組(P<0.05)。小鼠血清IL-6和TNF-α水平模型組高于對照組，而抑制劑組低于模型組(P<0.05；表1)。

表1 各組血清肌酐、尿素氮、炎癥因子的比較

2.4 抑制劑顯著抑制腎臟細胞凋亡

免疫組化和免疫蛋白印跡結果顯示，小鼠腎臟Caspase 3和Bax蛋白水平模型組高于對照組，而抑制劑組低于模型組(P<0.05；圖3)。

圖3 各組腎臟細胞凋亡蛋白水平的比較

3 討 論

膿毒血癥是以全身嚴重炎癥反應為特點的急性綜合征，常常累積多器官，造成多器官功能障礙[1]。腎臟是機體的代謝性器官，具有豐富的血運。因此，膿毒血癥常常造成急性腎臟損傷，而損傷的機制十分復雜，還有待探究。目前主要的學說有炎癥學說和腎臟血流動力學學說。其中，炎癥學說是較為廣泛接受的學說[13]。減少炎癥因子的釋放可能是治療膿毒血癥急性腎損傷的重要靶點。雖然目前已經發現了許多抑制膿毒血癥炎癥因子上調的藥物，但是這些藥物本身會加重腎臟損傷。因此，應該靶向于內源性的細胞因子來抑制膿毒血癥中炎癥因子的變化。IL-17A是機體內源性的細胞因子，具有促進促進中性粒細胞遷移和誘導細胞因子和趨化因子表達的作用[7-8]。膿毒血癥患者的IL-17A水平是顯著上調的，因此，本研究旨在探究抑制內源性IL-17A對膿毒血癥急性腎損傷的作用。

本研究首先通過腹腔注射LPS構建了小鼠膿毒血癥模型，HE染色、血清肌酐和尿素氮水平的檢測都證實了LPS能夠誘導小鼠膿毒血癥急性腎損傷的發生，IL-17A抑制劑是直接抑制IL-17A的產生和組裝，根據KEGG數據庫預測，抑制劑可能抑制了NF-κB通路，從而抑制了炎癥反應。本研究通過給與膿毒血癥急性腎損傷小鼠模型IL-17A抑制劑處理，顯著降低了血清肌酐和尿素氮水平，提示抑制IL-17A的表達能夠治療膿毒血癥急性腎損傷。臨床表型的改善都是基于病理的改善。因此，本研究進一步探究了膿毒血癥小鼠腎臟的變化。HE染色和糖原染色結果顯示，膿毒血癥小鼠腎臟結構紊亂，腎小管嚴重受損，而IL-17A抑制劑能夠顯著改善小鼠腎臟損傷，病理結果進一步證實了IL-17A抑制劑處理能夠顯著改善膿毒血癥急性腎損傷。

研究發現，膿毒血癥小鼠腎臟的炎癥因子水平是顯著上調的[14]，而采用IL-17A抑制劑處理后，腎臟中炎癥因子的水平是下調的。本研究結果顯示，膿毒血癥小鼠腎臟細胞的Caspase 3和Bax蛋白含量是顯著升高。Caspase 3/Bax通路是細胞凋亡途徑的重要分子，其表達量的上調代表著細胞凋亡的增加。本研究結果顯示，IL-17A抑制劑能夠下調Caspase 3和Bax蛋白水平，提示其能夠減少腎臟細胞凋亡。