人參皂苷通過NF-κB/NLRP3途徑改善狼瘡性腎炎小鼠腎損傷

許詣， 秦建品， 沈文婷

(湖北文理學院附屬醫院襄陽市中心醫院兒科，湖北省襄陽市 441021)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的嚴重并發癥之一，隨著病情發展，可導致患者因終末期腎病而死亡，機體免疫系統異常激活引發的全身炎癥是其主要發病機制[1-2]。抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)信號激活，減輕炎癥，降低免疫復合物沉積，進而降低腎細胞凋亡，改善LN癥狀[3-4]。人參皂苷能降低炎癥介質表達，減弱過氧化反應，對風濕性疾病具有較好的療效[5]，且人參皂苷Rg1可阻斷膿毒癥小鼠TLR4/NF-κB/NLRP3信號轉導，減輕組織炎癥損傷[6]。本文觀察人參皂苷對LN小鼠腎損傷及NF-κB/NLRP3通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人參皂苷Rg1(成都普菲德生物技術有限公司)；醋酸潑尼松片(上海信誼藥廠有限公司)；FITC標記的羊抗小鼠抗IgG熒光抗體(北京中杉金橋公司)；小鼠抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)酶聯免疫分析試劑盒、小鼠抗雙鏈(double-stranded DNA，dsDNA)抗體酶聯免疫分析試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；小鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯免疫分析試劑盒、小鼠干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)酶聯免疫分析試劑盒、兔源NF-κB p65一抗、兔源PCNA一抗、兔源NLRP3抗體、兔源GAPDH一抗、羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒、HE染色試劑盒、BCA蛋白質定量檢測試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)。

Combas c311全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)；RT6500酶標儀(美國雷杜公司)；DM750正置光學顯微鏡(徠克顯微系統有限公司)；YKY-1000四激發倒置熒光顯微鏡(上海永科光學儀器有限公司)；YGQ-3126F輪轉式切片機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司)；PowerPac 3000轉膜儀、Mini PROTEAN蛋白電泳儀(美國伯樂公司)；Image Master凝膠成像分析儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 動物及分組

60只C57BL/6紅斑狼瘡(MRL/lpr)雌性小鼠及12只C57BL/6雌性小鼠購自華中科技大學實驗動物中心[SCXK(鄂)2018-0009]，體質量18～22 g，12周齡。嚴格按照實驗動物規范條例進行飼養，溫度22～24 ℃，濕度50%～55%，12 h/12 h明暗循環光照。

將60只MRL/lpr雌性小鼠隨機均分為模型組、人參皂苷低(29 mg/kg)、中(58 mg/kg)、高(116 mg/kg)劑量組、醋酸潑尼松(6 mg/kg)組，每組12只，另12只C57BL/6雌性小鼠設為對照組。將人參皂苷Rg1和醋酸潑尼松分別制為相應質量濃度的人參皂苷藥液[7]和醋酸潑尼松藥液[8]，給藥組小鼠以10 mL/kg的劑量灌胃，模型組和對照組以相同劑量的生理鹽水灌胃，每天上午灌胃1次，共給藥21天。

1.3 觀察小鼠一般情況及測定腎功能指標

小鼠末次給藥結束后，觀察各組小鼠一般情況，包括食量、活動情況、體質量、精神狀態、毛色等。收集其24 h內尿液，然后以乙醚麻醉小鼠，自頸動脈采血1.2 mL，離心收集血清，全自動生化分析儀測定尿液24 h尿蛋白及血清肌酐(creatinine，Cr)含量，剩余血清保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 HE染色檢測小鼠腎組織病理改變情況

處死小鼠，解剖取出腎臟，剪下0.5 g腎組織，勻漿并采用細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒分別提取其細胞核蛋白及細胞漿蛋白，保存在-80 ℃冰箱。其余腎組織進行固定、脫水、透明、包埋處理后，2 μm切片，脫蠟、梯度乙醇浸泡、PBS漂洗處理后，行HE染色，再次脫水、透明后封片，普通光學顯微鏡觀察并拍照。

1.5 免疫熒光染色檢測腎組織IgG免疫復合物沉積

腎組織切片經脫蠟、梯度乙醇浸泡、PBS漂洗處理后，滴加FITC標記的羊抗小鼠抗IgG熒光抗體，避光，室溫孵育3 h，PBS漂洗3遍，避光封片，通過熒光顯微鏡觀察并拍照，以軟件Image Pro Plus 6.0對圖像熒光強度進行分析。

1.6 酶聯免疫吸附法檢測血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量

酶聯免疫吸附法測定血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ水平，具體按照各試劑盒說明書進行操作。

1.7 Western blotting檢測腎組織NF-κB/NLRP3通路相關蛋白

BCA法測定細胞核蛋白及細胞漿蛋白樣品液蛋白總含量，混入適量上樣緩沖液，煮沸5 min變性，各組分別取20 μg蛋白，加入SDS-PAGE濃縮膠上樣孔中，110 V恒壓電泳并濕轉至硝酸纖維素膜，使用3%牛血清白蛋白溶液室溫孵育硝酸纖維素膜，封閉膜上蛋白，分別使用兔源NF-κB p65、NLRP3、GAPDH、PCNA一抗溶液4 ℃孵育8 h，TBST溶液漂洗，采用羊抗兔二抗溶液室溫孵育2 h，TBST溶液再次漂洗，滴加化學發光顯色液，顯影蛋白條帶，凝膠成像分析儀拍照并使用Image-J軟件分析圖像蛋白條帶灰度值，最后得出NLRP3、核內NF-κB p65蛋白相對表達。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況及腎功能比較

對照組小鼠飲食、活動正常，毛色光滑。模型組小鼠精神萎靡、反應遲鈍、活動減少、食欲減退、毛色暗淡，體質量較對照組明顯減輕。人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠上述癥狀較模型組得到改善，且人參皂苷高劑量組和醋酸潑尼松組上述癥狀改善最明顯。與對照組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，其他給藥組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05；表1)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量比較，差異無顯著性(P>0.05)。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量比較(n=12)

2.2 各組腎組織病理形態比較

對照組小鼠腎組織形態結構清晰，未見病理損傷。模型組小鼠腎小管上皮細胞變性壞死，呈空泡及顆粒狀，腎小球系膜彌漫性增生，有節段性白金耳樣結構形成，并有炎癥細胞浸潤，腎組織發生嚴重病理損傷。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠腎組織上述病理損傷減輕，且人參皂苷劑量越高，病理損傷越輕；人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組小鼠腎組織形態幾乎恢復正常，兩者無明顯差異(圖1)。

圖1 各組小鼠腎組織病理形態(HE染色，400×)

2.3 各組腎組織IgG免疫復合物沉積比較

與對照組比較，模型組小鼠腎組織有大量IgG免疫復合物沉積，其熒光強度明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠腎組織IgG免疫復合物沉積減少，其熒光強度降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組小鼠腎組織IgG免疫復合物沉積及其熒光強度比較，差異無統計學意義(P>0.05；圖2)。

圖2 各組小鼠腎組織IgG免疫復合物沉積及免疫熒光強度

2.4 各組血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量比較

與對照組比較，模型組小鼠血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組上述指標含量降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組上述指標比較，差異無統計學意義(P>0.05；表2)。

表2 各組小鼠血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ和NF-κB/NLRP3通路相關蛋白比較(n=12)

2.5 各組腎組織NF-κB/NLRP3通路相關蛋白表達水平

與對照組比較，模型組小鼠腎組織NF-κB/NLRP3通路相關蛋白(核內NF-κB p65、NLRP3)表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組上述指標相關蛋白表達水平降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組相關蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05；表2)。

3 討 論

LN的主要病理特征為免疫系統異常激活，SLE特異性標志物抗dsDNA抗體、ANA含量及血清炎癥因子水平明顯升高，大量IgG免疫復合物沉積于腎組織[9-11]。本文中MRL/lpr雌性小鼠精神萎靡、食欲減退、毛色暗淡，體質量較正常小鼠明顯減輕，血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量明顯升高，腎組織發生明顯病理損傷，腎功能指標異常，腎組織有IgG免疫復合物沉積，表明MRL/lpr雌性小鼠具有LN的主要臨床癥狀，可作為LN模型用來研究。

人參皂苷是傳統名貴中藥人參干燥根莖的主要有效成分，具有抑制炎癥、減弱氧化應激等藥理活性，其家族成員人參皂苷Rg1可下調NF-κB信號，降低促炎因子表達釋放，減弱氧化應激及炎癥反應，保護神經細胞，減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷；人參皂甙Rg3能明顯降低腎細胞凋亡，緩解糖尿病腎病大鼠腎組織損傷[12-13]。本文結果顯示，人參皂苷可改善小鼠精神萎靡、食欲減退、毛色暗淡、體質量減輕等癥狀，減輕LN小鼠腎組織病理損傷，降低24 h尿蛋白、Cr、ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β及IFN-γ含量、腎組織IgG免疫復合物沉積，表明人參皂苷可降低LN小鼠炎癥因子水平，緩解其免疫系統異常激活，減少IgG免疫復合物沉積，減輕腎組織炎性損傷，改善腎功能障礙，并隨劑量升高而作用增強。

NF-κB/NLRP3在LN的發生及疾病進展過程中起到關鍵調控作用，激活該信號，可啟動炎癥，導致LN發生發展；抑制NF-κB激活，可下調NLRP3炎癥小體生成，阻斷炎癥，減輕SLE引起的腎臟氧化應激和炎癥損傷，修復腎功能[14-15]。本研究以不同劑量人參皂苷處理LN小鼠，可降低其腎組織核內NF-κB及NLRP3蛋白表達水平，并隨劑量升高而作用增強，表明人參皂苷改善小鼠LN臨床癥狀可能是通過NF-κB/NLRP3通路蛋白表達實現的。

綜上所述，人參皂苷可降低NF-κB p65的核轉移和NLRP3蛋白表達，減弱炎癥，降低腎組織IgG免疫復合物沉積，減輕腎損傷，修復腎功能，改善MRL/lpr小鼠臨床癥狀，為SLE和LN的臨床治療提供了新思路，阻滯NF-κB/NLRP3信號轉導可能是其藥理機制，但本文的證據還存在一定不足，后續需通過激活和抑制該通路進行對照驗證，以便對其進行更準確全面的闡述。