退變腰椎間盤髓核組織HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ的表達及相關性

盧飛， 吳宇鵬， 姚女兆

(南華大學衡陽醫學院附屬第一醫院脊柱外科，湖南省衡陽市 421001)

腰椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起腰腿疼痛的主要原因，但具體機制尚不明確[1]。高遷移率族蛋白2(high mobility group box 2，HMGB2)和淋巴樣增強因子-1(lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF1)能夠共同作用增強Wnt信號通路，并促進軟骨細胞的生物學過程。當HMGB2和LEF-1之間的相互作用下降甚至消失，則可導致軟骨退行性改變。椎間盤髓核細胞為類軟骨細胞，軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen，Col Ⅱ)降低可能是軟骨細胞退行性改變的分子作用機制之一[2]。本文探討HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ在退變腰椎間盤髓核組織中的表達及其相關性，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2020年7月1日—12月31日就診于本院脊柱外科17～69歲患者20例手術標本(標準后路腰椎手術或椎間孔鏡手術獲取相對完整髓核新鮮組織)，存放于-80 ℃超低溫冰柜。術前患者已知情同意且簽署知情同意書。采用Pfirrmann分級方法對患者椎間盤退變程度進行分級，Ⅱ級、Ⅲ級為輕度退變組，Ⅳ、Ⅴ級為重度退變組。納入輕度及重度退變組標本各10例。此次研究已獲得本院倫理委員會批準。排除病例：①嚴重心、肝、腎等器質性疾??；②嚴重腰椎感染性疾病；③類風濕疾??；④脊柱原發性或轉移性腫瘤；⑤慢性糖尿??；⑥系統性紅斑狼瘡等全身免疫系統疾??；⑦兩次或多次脊柱或腰椎手術患者；⑧信息資料不全。

1.2 qRT-PCR實驗

采用TRIzol法提取總RNA。HMGB2引物序列上游5′-AGTCAGCCAAAGATAAACAACCA-3′，下游5′-TCCTGCTTCACTTTTGCCCTT-3′;LEF-1引物序列上游5′-AGAACACCCCGATGACGGA-3′，下游5′-GGCATCATTATGTACCCGGAAT-3′;Col Ⅱ引物序列上游5′-GCGGTAGAGACCCGGACC-3′，下游5′-TCCGGCTTCCACACATCCTTA-3′。根據TRIzol試劑說明書提取髓核組織總RNA。按試劑盒說明書選擇RT試劑盒進行反轉錄后，再完成PCR檢測，所有反應的產物均應用Melt曲線進行分析，采用ΔΔCt方法檢測其相對表達量。實驗均重復3次。

1.3 Western boltting檢測

髓核細胞3 000 r/min離心10 min，4 ℃離心棄上清，用PBS先后沖洗3次去掉廢液，沉淀后加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液，冰上裂解30 min。將裂解后的細胞懸液置于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，獲取的上清液即為蛋白提取液，將其轉移到EP管，加入loading buffer在95 ℃煮10 min。SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后進行轉膜，將其轉至0.45 μm PVDF膜上，隨后將轉好的PVDF膜放至5%牛奶中封閉4 h，4 ℃孵育HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ和內參β-actin一抗過夜，完成一抗孵育后，用TBST緩沖液漂洗3次,每次15 min。再孵育2～4 h二抗，同樣用TBST緩沖液漂洗3次，每次15 min。顯影劑顯影后拍照。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA及蛋白水平的比較

與輕度退變組比較，重度退變組HMGB2、Col Ⅱ mRNA降低(P<0.05)；LEF-1 mRNA升高(P<0.05；表1)。與輕度退變組比較，重度退變組HMGB2蛋白表達降低(P<0.05；表2和圖1)。

表1 不同退變程度腰椎髓核組織HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA水平的比較

表2 不同退變程度腰椎髓核組織HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ蛋白水平的比較

圖1 Western blotting檢測結果

2.2 HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA水平的相關性分析

Pearson分析結果顯示，HMGB2 mRNA水平與Col Ⅱ mRNA水平呈正相關，與LEF-1 mRNA水平呈負相關；LEF-1 mRNA水平與Col Ⅱ mRNA水平呈負相關(P<0.05；表3)。

表3 腰椎間盤髓核組織中HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA表達水平的相關性

3 討 論

HMGB2參與體內DNA修復、基因轉錄調控、細胞增殖、細胞轉移等過程[3]。關節軟骨的淺表區可以產生潤滑素[4-5]，而潤滑素是一種重要的關節潤滑劑[6-7]。研究發現，人類患骨關節炎可致軟骨中HMGB2的表達水平降低或消失[8]。潤滑素的空間分布與HMGB2相似，并參與軟骨和關節內穩態[9]。由于滑膜中HMGB2表達的減少與潤滑素在關節軟骨淺表區的表達缺失無相關性，提示HMGB2在連接軟骨淺表區細胞中具有獨特的作用[10]。因椎間盤髓核細胞與關節軟骨細胞具有高度同源性，故推測椎間盤髓核細胞中HMGB2可能具有類似關節軟骨中HMGB2相似功能。本文重度退變組HMGB2表達較輕度退變組降低(P<0.05)，提示HMGB2可能為IDD發生和病情進展的預測性指標。

LEF-1主要通過HMG結合域[11]和β-catenin結合域[12-13]發揮作用，與細胞的分化、腫瘤的發生有關。HMGB2增強了LEF-1與其靶序列的結合，促進了LEF-1-β-catenin復合物的轉錄激活。研究表明，Wnt/β-catenin的激活可以促進髓核母細胞的增殖，觸發細胞衰老的發生，從而誘導IDD發生和病情的加重[14]。LEF-1在體外實驗和體內實驗都影響著成骨細胞的增殖、成熟和再生[13]。本文重度退變組LEF-1相對表達較輕度退變組升高，提示LEF-1的表達水平與髓核退變程度有關，臨床上早期評估IDD患者疾病進展和病情嚴重程度可考慮利用LEF-1作為候選指標，通過檢測其表達量判斷IDD的發生與發展。

以上研究表明HMGB2和LEF-1可能在Wnt/β-catenin信號通路中也發揮發著重要作用，但具體機制有待進一步研究。