酶法制備絲素肽及結構性能測試

李玉梅，林海濤*，李淋倍，趙心雨，鄭祚福

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2.廣東江門中醫藥職業學院，廣東 江門 529080)

蠶絲的主要成分是絲素蛋白，絲素蛋白是一種具有內在特性的蛋白質，是一種天然高分子材料[1-2]。傳統上，絲素蛋白主要是作為紡織纖維原料使用。近年來人們對絲素蛋白的興趣急劇增加[3-7]，不斷拓寬絲素蛋白的研究領域，其主要被應用在食品、化妝品、醫用材料、臨床診斷治療、環境保護及生物制藥等不同領域。在食品領域，目前需要解決的問題之一是如何最大程度地利用絲素蛋白。絲素蛋白因其獨特的結構，非常堅韌，難以水解[8]。因此，本文選用6種蛋白酶水解絲素蛋白，從中選出水解條件最好的蛋白酶，再進行水解條件的優化，達到充分水解絲素蛋白的目的。

食品添加劑能改善食品的色、香、味等，從而增加人們的食欲；還可應用于食品的保鮮和防腐，提高食品生產的經濟效益[9-12]。隨著時代的發展，食品添加劑在現代食品工業中逐漸變得不可或缺，但過量使用食品添加劑會危害人們的健康，因此國家對食品添加劑的使用范圍做出了嚴格的規范[13-14]。本文主要研究絲素肽的最佳工藝條件，以便將其應用于食品添加劑或功能性食品等領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑蠶繭：廣西鹿寨縣貴盛繭絲工貿有限公司；鹽酸(AR)：西隴化工股份有限公司；無水乙醇(AR)：成都市科隆化學品有限公司；堿性蛋白酶：河南仰韶生物科技有限公司；NaOH(AR)、甲醇(AR)：天津市科密歐化學試劑有限公司；中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶：和氏璧生物科技有限公司；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

UPT-I-10T實驗室超純水機 四川優普超純科技有限公司；Y(B)802N八籃恒溫烘箱 溫州大榮紡織儀器有限公司；H1850R醫用離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；YB71丹尼爾電子天平 常州市幸運電子設備有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；LGJ-10D冷凍干燥機 上海諾頂儀器設備有限公司；堿式滴定管 上海帥登儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器 鄭州生元儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 pH-stat法[15]測定水解度

蛋白質水解過程中存在著質子，質子有兩種狀態：一種是吸收，另一種是釋放。在水解過程中加入堿或酸使pH保持不變，質子就會發生變化，因此，能通過消耗堿的量，得到水解度。

式中：B表示維持pH值不變消耗堿的量，mL；Nb表示實驗中配制的堿濃度，mol/mL；a=10pH-pK/(1+10pH-pK)，其中pH是加入堿后維持不變的值，pK=7.0；a表示氨基的平均解離度；m表示絲素蛋白溶液中總蛋白質含量，g；htot表示絲素蛋白溶液中蛋白質的肽鍵總數，mmol/g，htot=12.4 mmol/g。

1.3.2 甲醇滴定法測定水解度

向絲素蛋白溶液中加入堿性蛋白酶進行酶解3 h。此時酶解液中還存在酶的活性，需要在100 ℃的沸水中進行滅酶20 min，得到失活的酶解液，用移液槍移取失活的酶解液5.0 mL于燒杯中，用量筒稱取60 mL去離子水于裝有酶解液的燒杯中。將燒杯置于磁力旋轉器上，打開開關，進行旋轉。用pH計將pH值調為7，用量筒稱取中性甲醇溶液10 mL，倒入燒杯，進行旋轉混勻。配制氫氧化鈉溶液，用堿式滴定管滴定到數值為9.2，記錄滴定到數值為9.2消耗氫氧化鈉溶液的體積數為V1(mL)。

用移液槍移取絲素蛋白溶液5.0 mL置于燒杯中，用量筒稱取60 mL去離子水于裝有絲素蛋白溶液的燒杯中。將燒杯置于磁力旋轉器上，打開開關，進行旋轉。用pH計將pH值調為7，用量筒稱取中性甲醇溶液10 mL，倒入燒杯，進行旋轉混勻。用堿式滴定管滴定到數值為9.2，記錄滴定到數值為9.2的絲素蛋白溶液消耗氫氧化鈉溶液的體積數為V2(mL)。

DH(%)=M(V1-V2)×(1000/CWOV)×(1/htot)×100%。

式中：M表示實驗中配制的堿濃度，mol/L；V1表示滴定到數值為9.2的酶解液消耗的氫氧化鈉溶液的體積數，mL；V2表示滴定到數值為9.2的絲素蛋白溶液消耗氫氧化鈉溶液的體積數，mL；CWO表示絲素蛋白溶液的質量濃度，g/L；V表示中性甲醇溶液的體積數，mL；htot表示絲素蛋白溶液中蛋白質的肽鍵總數，mmol/g，htot=12.4 mmol/g。

1.3.3 蛋白酶的選擇

根據經濟和適用的情況，絲素蛋白水解主要選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶這6種酶。配制一定濃度的絲素蛋白溶液，100 ℃加熱5 min，加入酶，用1 mol/L NaOH標準溶液滴定至所需的pH值，最適溫度下反應一定時間。以水解度大小為指標，獲得最佳適用酶。蛋白酶的最適條件見表1。

表1 6種蛋白酶的反應條件Table 1 Reaction conditions of six proteases

1.3.4 絲素蛋白酶解反應的單因素實驗

在酶解反應中，為了使酶解反應充分進行，需要篩選合適的酶解條件。底物濃度、pH、酶解時間、溫度、加酶量這5個因素都會影響酶解的效果。因而進行單因素實驗，首先固定酶解時間為3 h、底物濃度為3%、加酶量為10000 U/g、pH為10，改變溫度，設定為40，45，50，55，60，65 ℃測水解度，水解度越高越好，選水解度最高的溫度做下一個單因素實驗；酶的活性部位對反應體系pH的變化較為敏感，設定pH為7，8，9，10，11，12測水解度，最適的pH值能使酶表現出最大的催化功能；加酶量增加，水解度增加，設定加酶量為7000，8000，9000，10000，11000，12000 U/g測水解度，最佳的加酶量酶解效果最好；底物濃度的高低直接影響水解度，設定底物濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%測水解度；固定加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10、底物濃度為2%，改變酶解時間，設定為30，60，90，120，150，180 min測水解度，選擇獲得產物最多的酶解時間。

1.3.5 正交實驗優化絲素蛋白酶解條件的研究

選好蛋白酶的種類后，通過單因素實驗發現底物濃度和pH對酶解效果的影響很小，因此選用溫度、加酶量、酶解時間做正交實驗。正交實驗因素水平表見表2。

表2 L9(33)正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(33) orthogonal test

底物絲素蛋白溶液與酶在恒溫水浴鍋中不斷反應，使pH值一直保持在實驗規定的范圍內。水解反應終止時，放入滾燙的熱水100 ℃煮沸20 min，冷卻后，用移液槍移取失活后的酶解液測水解度。酶解液以10000 r/min的速度離心20 min，獲得上清液和沉淀物，將上清液用冷凍干燥機制成絲素肽粉末。

1.4 測定方法

1.4.1 傅里葉紅外光譜(FTIR)測試分析

取絲素在最佳酶解工藝條件下得到的肽液，進行冷凍干燥，干燥48 h，制成粉末，粉末與溴化鉀按1∶100的比例進行混合，放入模具，用壓片機壓成片，用紅外光譜儀進行測試。

1.4.2 表面形貌觀察

采用日立S-570型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察冷凍干燥制備的絲素肽粉的形態結構。用牙簽將絲素肽粉粘貼在圓臺上，進行噴金處理，或者將酶解后的絲素肽液進行滅酶離心，取離心后的澄清液滴到載玻片上，置于60 ℃烘箱中烘干。用電子顯微鏡對烘干后的樣品進行形貌觀察。

1.4.3 粒度分布測試

利用馬爾文激光粒度儀對絲素在最佳酶解工藝條件下得到的肽液進行粒度分布測試。在粒度分布測試之前要先測好樣品的吸光度和折射率。馬爾文激光粒度儀開機后，要先輸入樣品的吸光度和折射率，再進行粒度分布測試。

2 結果與分析

2.1 兩種方法對絲素蛋白水解能力的比較

用甲醛滴定法和pH-stat法測定6種蛋白酶在最適條件下的水解能力，水解度見圖1～圖6。

在同一底物存在的情況下，不同酶的切割位點不同，而且具有差異性，導致酶解產物多肽含量不同。用不同的蛋白酶對絲素蛋白進行酶解實驗，用甲醛滴定法和pH-stat法這兩種方法來測定不同蛋白酶對絲素蛋白的水解度。由圖1可知，甲醛滴定法測得的水解度比pH-stat法測得的高，堿性蛋白酶水解度最高，達到4.7%。因此，選用堿性蛋白酶作為絲素蛋白酶解用酶。

2.2 堿性蛋白酶催化絲素蛋白水解反應的研究

2.2.1 溫度對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響

圖2 溫度對酶解絲素蛋白水解反應的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis of silk fibroin

溫度對酶解效果的影響很大，合適的溫度會加速酶的反應，使其迅速溶解，得到更多的樣品。溫度過高，酶失活，不反應，得到的樣品少；溫度過低，反應慢，得到的樣品也少。由圖2可知，在40～45 ℃區間內，水解度緩慢上升，在45～55 ℃區間內，水解反應更迅速，水解度上升更快。在55～60 ℃區間內，水解度迅速下降。在60～65 ℃區間內，水解度緩慢下降。從整體上看，水解反應的最適溫度為55 ℃。

2.2.2 pH對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響

固定酶解時間為3 h、底物濃度為3%、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃，改變pH，設定為7，8，9，10，11，12，其對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響見圖3。

圖3 pH對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis of silk fibroin by alkaline protease

由圖3可知，pH在7～9區間內，水解反應的速度很快，水解度上升迅速。pH在9～10區間內，水解度緩慢上升。pH在10～12區間內，水解度呈下降趨勢。從整體上看，水解反應的最適pH為10。

2.2.3 加酶量對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響

固定酶解時間為3 h、底物濃度為3%、溫度為55 ℃、pH為10，改變加酶量，設定為7000，8000，9000，10000，11000，12000 U/g，其對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響見圖4。

圖4 加酶量對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響Fig.4 Effect of addition amount of enzyme on hydrolysis of silk fibroin by alkaline protease

由圖4可知，加酶量在7000～10000 U/g區間內，水解反應的速度很快。加酶量在10000～12000 U/g區間內，水解度緩慢上升，變化不明顯。從整體上看，絲素蛋白水解反應的最佳加酶量為10000 U/g。

2.2.4 底物濃度對絲素蛋白酶解效果的影響

固定酶解時間為3 h、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10，改變底物濃度，設定為1%、2%、3%、4%、5%、6%，其對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響見圖5。

圖5 底物濃度對酶解絲素蛋白效果的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of silk fibroin

由圖5可知，底物濃度在1%～3%區間內，水解度呈下降趨勢，下降很快。底物濃度在3%～4%區間內，水解度緩慢下降。底物濃度在4%～6%區間內，水解度也在緩慢下降，但下降得不明顯。從整體上看，底物濃度為1%的水解效果最好。但考慮到濃度過低會影響生產效率，因此選擇2%為最佳底物濃度。

2.2.5 酶解時間對絲素蛋白酶解效果的影響

固定加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10、底物濃度為2%，改變酶解時間，設定為30，60，90，120，150，180 min，其對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響見圖6。

圖6 酶解時間對堿性蛋白酶酶解絲素蛋白水解反應的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis of silk fibroin by alkaline protease

由圖6可知，酶解時間在30～180 min區間內，水解度均呈上升趨勢。為獲得肽含量高的絲素酶解液，選擇120 min作為堿性蛋白酶酶解絲素蛋白的最佳時間。

2.3 堿性蛋白酶催化絲素蛋白水解反應的正交實驗優化研究

根據單因素實驗的結果，由于pH和底物濃度對實驗結果的影響小，選擇溫度(A)、加酶量(B)、酶解時間(C)3個因素進行正交實驗，每個因素選取3個水平，實驗結果見表3。

表3 L9(33)正交實驗結果Table 3 L9(33) orthogonal experiment results

2.4 紅外光譜分析

固定底物濃度為2%、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10，不同酶解時間制備的絲素肽粉的紅外光譜圖見圖7。

圖7 酶法制備絲素肽的紅外吸收光譜圖Fig.7 Infrared absorption spectra of silk fibroin peptide prepared by enzymatic method

2.5 絲素肽的表面形貌

對不同方式制作的SEM測試樣進行觀測，得到的酶解絲素肽的表面形貌圖見圖8。

圖8 酶解絲素肽SEM圖Fig.8 SEM images of enzymatic hydrolysis of silk fibroin peptide

相互對比發現，經冷凍干燥制備的絲素肽顆粒發生團聚現象，顆粒大且形狀不規則。由圖8中D～F可以看出絲素肽的粒徑已經達到納米級。

2.6 粒徑分析

固定底物濃度為2%、加酶量為10000 U/g、溫度為55 ℃、pH為10，不同酶解時間制備的絲素肽液的粒徑分布圖見圖9。

圖9 絲素肽液粒度分布圖Fig.9 Particle size distribution of silk fibroin peptide solution

由圖9可知，絲素肽液的粒徑分布基本集中在100～700 nm之間。其中酶解時間為30 min的絲素肽粉粒度分級在200～700 nm呈正態對數分布，體積密度在粒度分級為404 nm左右達到最大值。酶解時間為60 min的絲素肽粉粒度分級在200～500 nm呈正態對數分布，體積密度在粒度分級為269 nm左右達到最大值。酶解時間為90，150 min的絲素肽粉粒度分級在100～500 nm呈正態對數分布，體積密度在粒度分級為202 nm左右達到最大值[18]。

3 結語

本文以超聲輔助低濃度堿溶解的絲素蛋白溶液為原料，通過單因素實驗、正交實驗得出，在最適水解條件下，加酶量為10000 U/g，溫度為55 ℃，pH為10，絲素蛋白溶液底物濃度為2%，酶解150 min后得到水解度為8.55%的絲素肽溶液，絲素肽顆粒大且形狀不規則。150 min制備的絲素肽粉粒度分級在100～500 nm呈正態對數分布，體積密度在粒度分級為202 nm左右達到最大值。此研究可為制備絲素肽液提供充分的參考依據。絲素肽含有人體所需的氨基酸，又是一種純蛋白，有降低膽固醇和促進酒精代謝的作用，對免疫性疾病有預防作用，因此在食品添加劑、功能性食品方面有很高的應用價值。