響應面法優化槲皮素納米粒的制備工藝

秦治國，劉濤

(青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042)

槲皮素作為八角[1-2]等天然調味品中的一種黃酮類化合物(總黃酮含量約占13.3%)具有多種生物活性，例如抗病毒、抗炎、抗氧化、抗冠心病、抗糖尿病、調節免疫力、抗癌等[3-4]。由于槲皮素具有較好的抗氧化性，因此可作為天然的抗氧化劑應用在食品及醫藥等方面。但是，槲皮素水溶性差的特點嚴重限制了槲皮素活性的發揮及應用[5]。

納米混懸液是指活性成分和表面活性劑形成的膠體分散體系，顆粒粒徑范圍為1～1000 nm[6]。納米混懸液的制備通常采用自上而下(如研磨或高壓均質)和自下而上(如抗溶劑沉淀)的方法[7]。固體分散體是原料與載體介質(PVP、PEG和HPMC等)中所形成的分散體系[8]，具有改善溶解度和提高溶解速率的特點[9-10]，通常采用冷凍干燥、淬火冷卻、噴霧干燥或旋轉蒸發等技術。近幾十年來，固體分散體技術被用于保健食品領域，極大地提高了動植物提取物中活性成分的溶解度、穩定性、療效等，具有廣闊的應用前景[11]。

本研究采用響應面法對壓力、循環次數和濃度3個影響因素進行因素水平設計，優化了八角提取物中槲皮素納米粒的制備工藝參數，減少了實驗的次數。采用兩步法(固體分散體結合高壓均質技術)制備了槲皮素納米粒，旨在改善槲皮素溶解度差的問題，以提高槲皮素的抗氧化能力、延長食品的保存時間并改良食品的味道。

1 材料與設備

1.1 材料

槲皮素：上海阿拉丁生化科技有限公司；PVP-K30：廣東粵美化工有限公司；無水乙醇：天津富宇化工有限公司。

1.2 設備

高壓均質機 ATS工程有限公司；旋轉蒸發儀 上海石亨儀器設備有限公司；Zetasizer Nano ZS粒度測試儀 英國馬爾文儀器有限公司；超聲儀 無錫杰瑞安儀器設備有限公司；RC-6溶出儀 天津天光儀器有限公司；Rigaku D/max 2500 X射線衍射儀 日本株式會社理學公司；720N紫外可見分光光度計 上海精科實業有限公司；差示掃描量熱儀 德國耐馳儀器制造有限公司。

2 實驗方法

2.1 槲皮素固體分散體的制備

將槲皮素和PVP-K30 (2∶1)分別放入50 mL的無水乙醇中，超聲至溶液變澄清。將得到的溶液放入旋轉蒸發儀中快速干燥，設置溫度為50 ℃和轉速為100 r/min。

2.2 粉末X射線衍射(PXRD)

使用Rigaku D/max 2500 X射線衍射儀對槲皮素和槲皮素固體分散體進行表征。工作電壓和電流分別保持在40 kV和20 mA。掃描參數設置為0.02°/s，步長為5°～40°(2θ)。

2.3 差示掃描量熱法(DSC)

準確稱量槲皮素和槲皮素固體分散體，分別放置在帶有穿孔蓋的40 μL鋁鍋中加熱。在設定溫度范圍(30～340 ℃)內，以10 ℃/min的速率加熱樣品，并使用空白鋁鍋作為參考。

2.4 納米粒的制備

通過高壓均質法(HPH)制備濃度為1%槲皮素的納米晶體。取槲皮素和槲皮素固體分散體分別分散在75 mL溶液中，該溶液中含有1%的PVP-K30。使用超聲儀進行30 s的超聲處理，使其分散均勻。高壓均質機壓力設置為1300 bar，在經過20個均質化循環后獲得槲皮素納米粒。

2.5 光子相關譜法(PCS)

使用Zetasizer Nano ZS粒度測試儀在25 ℃下測量樣品的平均粒徑和多分散指數(PDI)。將20 μL納米懸浮液分散在1.5 mL水中稀釋制備測試樣品，每次測量3次。

2.6 體外的溶出實驗

根據《中國藥典》，在RC-6溶出度測試儀中采用槳法對槲皮素、槲皮素固體分散體以及它們的納米粒進行溶出度測量。槳速為100 r/min，溫度保持在(37±0.5) ℃，將樣品(含有5 mg槲皮素)分別加入到900 mL純水溶解介質中，分別在預定的時間抽取5 mL溶解樣品并過濾，使用720N紫外可見分光光度計在波長375 nm處測量樣品的吸光度,實驗重復3次。

2.7 單因素實驗

考察不同壓力、循環次數和槲皮素濃度對槲皮素粒徑的影響。初步設定壓力分別為800，1000，1200，1400 bar，其他條件為循環次數20次和槲皮素濃度2%；設定循環次數分別為10，15，20，25次，其他條件為壓力1200 bar和槲皮素濃度2%；設定槲皮素濃度分別為1%、2%、3%、4%，其他條件為壓力1200 bar和循環次數20次，每組實驗重復3次。

2.8 響應面設計

響應面通?？梢杂脕碓u價各因素對響應值的影響，在工藝的優化方面可以減少實驗次數和預測實驗結果[12-13]。根據文獻[14-15]，在單因素實驗的基礎上，選擇壓力(1000，1200，1400 bar)、循環次數(15，20，25次)和濃度(1%、2%、3%)，采用Design Expert 8.0軟件的中心組合實驗設計，以粒徑的大小為響應值。響應面設計因素與水平見表1。

表1 壓力、均質化循環次數和槲皮素濃度的響應面設計Table 1 Response surface design of pressure, homogenization cycle times and quercetin concentration

3 結果與分析

3.1 槲皮素樣品的固態表征

槲皮素原料的PXRD衍射圖見圖1中a，在2θ值為10.92，12.58，24.42，27.5時可以觀察到有明顯的衍射峰，表明其具有良好的結晶度。但是在槲皮素固體分散體的PXRD衍射圖上未檢測到明顯的特征峰，表明槲皮素晶體變為無定形狀態。由圖1中b可知，槲皮素原料在316.5 ℃時顯示吸熱熔融峰，而槲皮素固體分散體沒有觀測到顯著的吸熱熔融峰，這進一步驗證了上述的結論，固體分散體中槲皮素的晶型變為非晶態。

圖1 槲皮素和槲皮素固體分散體的粉末X射線衍射圖(PXRD)和差示掃描量熱圖(DSC)Fig.1 Powder X-ray diffraction (PXRD) and differential scanning calorimetry (DSC) of quercetin and quercetin solid dispersion

3.2 單因素實驗結果

由圖2中a可知，當壓力在800～1200 bar時，粒徑隨著壓力的增大而減小，隨后粒徑反而增大。循環次數對粒徑的影響與壓力相似，見圖2中b。隨著循環次數的增加，粒徑在循環20次時達到最小，之后粒徑隨著循環次數的增加而增大。由圖2中c可知，過高的槲皮素濃度會導致原料的最終粒徑過大，濃度在2%左右得到的粒徑較小。

圖2 壓力(a)、循環次數(b)和槲皮素濃度(c)對槲皮素粒徑的影響Fig.2 Effects of pressure (a), cycle times (b) and quercetin concentration (c) on quercetin particle size

3.3 響應面設計結果及分析

根據表1的影響因素，利用Design Expert軟件設計的15組實驗設計組合和實驗測得的粒徑大小見表2。

表2 響應面實驗設計結果Table 2 Response surface experimental design results

對表2中實驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到模型的回歸線性方程為Y=246.33-105.00A-42.88B+68.38C+15.00AB-17.50AC+39.25BC+129.71A2+93.96B2+148.96C2。

根據實驗設計結果進行數據處理，獲得響應面二次模型的方差分析，見表3。

表3 響應面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model

由表3可知，模型的F值為47.91和P值<0.05，說明模型具有較高的顯著性，回歸線性方程具有良好的擬合性，可對實驗結果進行預測。此外，壓力、循環次數和槲皮素濃度的P值均小于0.05，證明它們對粒徑都有著較大的影響。實驗因素的F值越大，表明該因素對響應值的影響越顯著[16]。壓力的F值為125.54，循環次數的F值為20.93，槲皮素濃度的F值為53.23，即各因素對粒徑的影響力強弱順序為壓力>槲皮素濃度>循環次數。

3.4 響應面圖分析

根據實驗數據繪制出的響應面圖見圖3～圖5，通過響應面坡度的陡峭程度來衡量各實驗因素對粒徑的影響強弱,坡度越陡峭表明影響力越大[17]。

圖3 壓力和循環次數對粒徑的影響Fig.3 Effect of pressure and cycle times on particle size

圖4 壓力和槲皮素濃度對粒徑的影響Fig.4 Effect of pressure and quercetin concentration on particle size

圖5 循環次數和槲皮素濃度對粒徑的影響Fig.5 Effect of cycle times and quercetin concentration on particle size

由圖3和圖4可知，壓力的坡度比循環次數和槲皮素濃度更為陡峭，表明其對粒徑的影響較大。由圖5可知，循環次數和槲皮素濃度的坡面呈現凹形，表明它們對粒徑的影響不是線性關系。槲皮素濃度的坡度相對于循環次數較為陡峭，說明槲皮素濃度對粒徑的影響比循環次數明顯。

以粒徑最小為工藝的最終優化目標，獲得的實驗因素組合(組合較多，僅列出部分)見表4。

表4 響應面優化設計和結果Table 4 Design and results of response surface optimization

為了考察工藝參數的準確性，選取多組數據進行實驗。當壓力為1306.67 bar、循環次數為21次和槲皮素濃度為2.00%時，實驗測得的粒徑為224 nm；當壓力為1320.00 bar、循環次數為23次和槲皮素濃度為1.60%時，實驗測得的粒徑為235 nm。試驗值和理論值相對誤差極小，證明采用響應面法優化的工藝參數具有可行性。根據上述組合設計出的最優工藝參數為：高壓均質機的壓力1300.00 bar、循環次數20次和槲皮素濃度2.00%。

3.5 體外的溶出度

在純水作為溶出介質的溶出實驗中，槲皮素原料在60 min時僅溶出8.2%。槲皮素固體分散體與原料相比顯示出更快、更高的溶解行為，其僅在5 min時就可釋放33%，遠高于槲皮素原料在60 min時的溶出度，原因是非晶態和PVP(潤濕性和分散性)的共同作用。槲皮素納米粒在3 min時就可溶出6.5%和60 min時達32.5%(大約是原料的4倍)，與槲皮素原料相比溶出度得到顯著的提升。這是由于減小粒徑可以增大顆粒與溶出介質的接觸面積，加快釋放速率和提高溶出度[18]。槲皮素固體分散體與槲皮素原料納米粒相比，表現出更高的溶出度和溶出速率,這說明槲皮素晶型的改變(即非晶態)對溶出度的影響比僅減小原料的粒徑更為顯著。在非晶態的基礎上減小粒徑，可以進一步提高溶出速率和溶出度。在顆粒尺寸的減小和非晶態雙重作用下，非晶態槲皮素納米粒在3 min就可溶出49.1%，10 min就可達到最大溶出度88.2%，表現出最快的溶出速率和最高的溶出度(大約是原料的11倍)。

圖6 槲皮素原料、槲皮素固體分散體以及它們的納米粒溶出曲線Fig.6 Dissolution curves of quercetin raw material, quercetin solid dispersion and their nanoparticles

由圖6可知，制備的槲皮素納米粒的溶出度得到極大的提高，預測在相同的抗氧化效果下，所需的用量比原料用量大大減小，對于調味等效果可帶來改變。

4 總結

通過將八角中提取的槲皮素與PVP-K30旋轉蒸發法制備得到的固體分散體進行納米化，制備得到的槲皮素固體分散體納米粒在純水中的溶出度與槲皮素原料相比顯示出極大的提高，這充分證實了兩步法(固體分散體結合高壓均質技術)在提高槲皮素溶出度方面的優勢。溶出度的提升預計可以提高其抗氧化能力，如果作為抗氧化劑用于食品中，可以延長食品的保存時間。采用響應面法對槲皮素固體分散體納米粒的制備工藝進行優化，為了便于實驗研究，確立最優的工藝參數組合為高壓均質機的壓力1300 bar、循環次數20次和槲皮素濃度2%，此時獲得的粒徑大小范圍在220～235 nm之間。