金果梨紫薯酵素混菌發(fā)酵工藝及其抗氧化活性

芮蓬，何佳*，劉錫銘，王濤

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.洛陽(yáng)市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023；3.河南尚長(zhǎng)河果業(yè)有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000)

金果梨(Hoveniaacerba)俗稱金果，呈扁圓形或近圓形，果皮較薄呈黃棕色，果肉石細(xì)胞較少、多汁[1]。果實(shí)中含有豐富的維生素、類黃酮、微量元素等物質(zhì)，具有潤(rùn)肺止咳、提高免疫力等功效[2-3]。因其日常生長(zhǎng)以及采收時(shí)極易發(fā)生機(jī)械損傷，每年會(huì)有大量殘次果無(wú)法正常上市銷售，造成大量果實(shí)浪費(fèi)，影響種植戶的經(jīng)濟(jì)收入。因此，金果梨深加工產(chǎn)品的研發(fā)迫在眉睫。目前金果梨的相關(guān)加工產(chǎn)品研究?jī)H有孟令冬等[4]利用金果梨為原料制作了一款凝膠軟糖，未見(jiàn)金果梨相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品的報(bào)道。

紫薯(purple sweet potato)又稱黑薯，富含淀粉、可溶性糖、維生素、氨基酸、鈣、磷、鐵等多種營(yíng)養(yǎng)成分[5]，此外，還富含硒元素和花青素[6]。在中醫(yī)理論上，梨屬寒性食物[7]，食用過(guò)多會(huì)對(duì)脾胃等產(chǎn)生傷害；紫薯屬溫性食物，可與梨的寒性形成陰陽(yáng)互補(bǔ)[8]。

目前市場(chǎng)上的大部分果蔬發(fā)酵飲品主要為多菌種同時(shí)發(fā)酵的酵素與果醋。上述兩種產(chǎn)品因在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量醋酸，飲用時(shí)酸度高、刺激性大[9-11]，不易被廣大消費(fèi)者接受，從而影響規(guī)模化原料加工生產(chǎn)。該酵素以金果梨和紫薯為原料，采用分階段發(fā)酵方式，將酵母菌與醋酸菌、乳酸菌進(jìn)行分階段接種發(fā)酵。在酵母發(fā)酵階段，利用巴氏殺菌技術(shù)及時(shí)殺滅酵母菌，降低終產(chǎn)物中醋酸含量，改善了產(chǎn)品的適口性。將金果梨與紫薯混合發(fā)酵，紫薯中豐富的花青素解決了梨汁發(fā)酵色澤單一的問(wèn)題，同時(shí)發(fā)酵液的低pH環(huán)境也使花青素穩(wěn)定保存[12]。本試驗(yàn)對(duì)乳酸菌和醋酸菌的混菌發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味良好、酸度較低的發(fā)酵產(chǎn)品，增加了金果梨的日常消耗，同時(shí)使金果梨殘次果得以利用，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行了研究，為金果梨紫薯酵素后續(xù)功能開(kāi)發(fā)研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

金果梨：河南尚長(zhǎng)河果業(yè)有限公司培育的尚長(zhǎng)河“金果”；紫薯：群紫1號(hào)，市售；高溫α-淀粉酶(食品級(jí)，40 U/mg)、果膠酶(食品級(jí)，40 U/mg)、糖化酶(食品級(jí)，100 U/mg)：上海藍(lán)季生物有限公司；酵母菌：葡萄酒·果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：滬釀曲種，成都曲賦生物科技有限公司；植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

DPPH(≥97%)：上海藍(lán)季生物有限公司；ABTS(≥96.5%)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tris-HCl(分析純)：南京奧多福尼生物科技有限公司；濃鹽酸(分析純)：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為天津市德恩化學(xué)試劑有限公司分析級(jí)試劑。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-S4電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；PH400 pH計(jì) 上海安萊立思儀器科技有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器公司；UV2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；TGL-16M離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金果梨紫薯酵素工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

酶解：加入0.12%高溫α-淀粉酶，混勻后于70 ℃水浴鍋中酶解3 h，中間搖勻2～3次。取出后自然冷卻至55 ℃，加入0.14%果膠酶和0.11%糖化酶，同上于55 ℃酶解2.5 h。

酵母發(fā)酵：待酶解液冷卻至30 ℃以下，再接入0.003%的酵母菌，于27 ℃發(fā)酵18 h。

巴氏滅菌：酵母菌發(fā)酵結(jié)束后立即進(jìn)行65 ℃巴氏滅菌30 min。

菌種活化：用等量的MRS培養(yǎng)基將冷藏的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌在37 ℃下活化培養(yǎng)20 h，然后按1∶1混合。用1%葡萄糖、0.05% KH2PO4、1%酵母浸粉配制的醋酸菌增殖培養(yǎng)基于115 ℃滅菌30 min，冷卻后加入4%的無(wú)水乙醇和醋酸菌，于33 ℃活化48 h。

混菌發(fā)酵：巴氏殺菌后冷卻至室溫，接入活化的乳酸菌和醋酸菌。

1.2.3 混菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

研究在一定條件下，乳酸菌接種量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、醋酸菌接種量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)、發(fā)酵時(shí)間(1，2，3，4，5 d)、發(fā)酵溫度(27，30，33，36，39 ℃)對(duì)總酸含量的影響，確定最佳混菌發(fā)酵條件范圍。

1.2.4 混菌發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乳酸菌接種量(A)、醋酸菌接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和發(fā)酵溫度(D)為變量，將發(fā)酵液感官評(píng)分與其總酸含量的加權(quán)綜合評(píng)分(Y)作為響應(yīng)值，進(jìn)行金果梨紫薯混菌發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 金果梨紫薯混菌發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 抗氧化活性試驗(yàn)

按照參考文獻(xiàn)[13-16]的方法，測(cè)定金果梨紫薯酵素對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧自由基的清除率，并與一定濃度的Vc進(jìn)行對(duì)比，分析其抗氧化能力。

1.2.6 測(cè)定方法

總酸含量：采用GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》方法進(jìn)行酸堿滴定(以乳酸計(jì))。

1.2.7 感官評(píng)定

表2 產(chǎn)品感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Sensory scoring standards for products

1.2.8 加權(quán)綜合分值Y的計(jì)算方法

參考李楊等[17]的方法，對(duì)金果梨紫薯酵素混菌發(fā)酵工藝進(jìn)行雙目標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分，因素集為U={總酸含量、感官評(píng)分}={U1、U2}，綜合評(píng)分值為Y。U1、U2函數(shù)關(guān)系如下:

式中：Xa為總酸含量的無(wú)量綱轉(zhuǎn)化值；Xb為感官評(píng)分的無(wú)量綱轉(zhuǎn)化值；y1為總酸含量；y2為感官評(píng)分值。

將響應(yīng)面試驗(yàn)兩個(gè)目標(biāo)結(jié)果代到綜合評(píng)價(jià)函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，評(píng)價(jià)函數(shù)Y如下：

金果梨紫薯酵素發(fā)酵的總酸含量和感官評(píng)分對(duì)成品都具有重要意義，選取的分配權(quán)重為γ={0.40,0.60}，即γ1為總酸的權(quán)重系數(shù)(γ1=0.40)，γ2為感官評(píng)分的權(quán)重系數(shù)(γ2=0.60)。

DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧自由基清除率的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[13-16]的方法進(jìn)行。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用Origin 2018進(jìn)行繪圖，響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行設(shè)計(jì)以及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乳酸菌接種量對(duì)總酸含量的影響

當(dāng)醋酸菌接種量為0.03%時(shí)，于33 ℃發(fā)酵4 d，不同乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵液總酸含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸菌接種量對(duì)總酸含量的影響Fig.1 The effect of lactic acid bacteria inoculation amount on total acid content

由圖1可知，隨著乳酸菌接種量的增加，發(fā)酵液的總酸含量先上升后趨于平穩(wěn)。接種量為2.5%時(shí)，總酸含量最高，為14.4 g/L。接種量較低時(shí)，乳酸菌菌種數(shù)量低，生長(zhǎng)代謝緩慢，導(dǎo)致總酸含量較低[18]。接種量大于2.0%時(shí)，有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)使乳酸菌產(chǎn)生種間競(jìng)爭(zhēng)，因而總酸含量增長(zhǎng)不明顯[19]。因此，選擇1.5%～2.5%為最佳接種范圍。

2.1.2 醋酸菌接種量對(duì)總酸含量的影響

當(dāng)乳酸菌接種量為2%時(shí)，于33 ℃發(fā)酵4 d，不同醋酸菌接種量對(duì)總酸含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 醋酸菌接種量對(duì)總酸含量的影響Fig.2 The effect of acetic acid bacteria inoculation amount on total acid content

由圖2可知，隨著醋酸菌接種量的增加，發(fā)酵液的總酸含量先上升后下降。當(dāng)接種量為0.03%時(shí)，總酸含量為15.12 g/L，達(dá)到最高，當(dāng)接種量大于0.03%時(shí)，會(huì)出現(xiàn)菌體過(guò)早老化，影響發(fā)酵效果[20]，同時(shí)過(guò)量的醋酸菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低總酸產(chǎn)量。因此，選擇0.02%～0.04%為最佳接種范圍。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響

當(dāng)乳酸菌接種量為2%、醋酸菌接種量為0.03%時(shí)，發(fā)酵4 d，不同發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響Fig.3 The effect of fermentation temperature on total acid content

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液的總酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化。當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量達(dá)到最高，為14.48 g/L。當(dāng)溫度較低時(shí)，乳酸菌和醋酸菌細(xì)胞內(nèi)的生物酶等活性受到抑制，使其生長(zhǎng)代謝變緩。溫度過(guò)高時(shí)，乳酸菌與醋酸菌短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)旺盛，導(dǎo)致菌體過(guò)早衰老[21]。因此，選取30～36 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量的影響

當(dāng)乳酸菌接種量為2%、醋酸菌接種量為0.03%時(shí)，在33 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量的影響Fig.4 The effect of fermentation time on total acid content

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液的總酸含量不斷上升最后趨于平穩(wěn)，發(fā)酵6 d時(shí)總酸含量達(dá)到最高，為15.99 g/L。在4 d以前，發(fā)酵液中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使乳酸菌和醋酸菌大量繁殖生長(zhǎng)代謝，發(fā)酵液中的總酸含量急速上升，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于4 d以后，發(fā)酵液中的總酸含量達(dá)到一定水平，較低的pH環(huán)境抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，使乳酸產(chǎn)生緩慢。同時(shí)發(fā)酵液中的酒精被大量消耗，醋酸菌無(wú)法繼續(xù)產(chǎn)生醋酸，且菌體出現(xiàn)老化也會(huì)影響醋酸菌的產(chǎn)酸能力[22]，導(dǎo)致4 d以后發(fā)酵液中總酸含量上升平緩。因此，選擇3～5 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2 金果梨紫薯混菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乳酸菌接種量(A)、醋酸菌接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和發(fā)酵溫度(D)為評(píng)價(jià)因素，以發(fā)酵液的總酸含量與其感官評(píng)分的加權(quán)綜合評(píng)分(Y)為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，各發(fā)酵因素與加權(quán)評(píng)分之間的二次回歸方程：Y=0.80-0.035A-7.799E-004B+0.18C-8.795E-003D+5.452E-003AB+1.618E-003AC+0.045AD-0.061BC-0.021BD-0.010CD-0.14A2-0.23B2-0.24C2-0.25D2。

表3 金果梨紫薯發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface test design and results of optimization of fermentation process conditions for Hovenia acerba and purple sweet potato

續(xù) 表

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

由表4可知，該回歸模型的F值為93.66，P值<0.0001，失擬項(xiàng)的P=0.5001>0.05，說(shuō)明該模型的擬合度較好。確定系數(shù)R2=0.9894，較正系數(shù)RAdj2=0.9789，表明該回歸方程的擬合程度高，可用于金果梨紫薯混菌發(fā)酵過(guò)程的分析和優(yōu)化。由回歸方程分析可知，不同發(fā)酵因素對(duì)綜合評(píng)分的影響效果由大到小為發(fā)酵時(shí)間(C)>乳酸菌接種量(A)>發(fā)酵溫度(D)>醋酸菌接種量(B)。各交互項(xiàng)中除AD對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(P<0.05)，BC對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P<0.01)，其余交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著(P>0.05)，各二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均極顯著(P<0.01)。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

對(duì)金果梨紫薯混菌發(fā)酵綜合評(píng)分有顯著影響的交互項(xiàng)為AD和BC，其響應(yīng)曲面與等高線見(jiàn)圖5。AD項(xiàng)與BC項(xiàng)均呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明具有較強(qiáng)的交互作用，同時(shí)BC交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面比AD交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面更加陡峭，印證了復(fù)合方差分析的BC交互項(xiàng)比AD交互項(xiàng)更加顯著的結(jié)果。

圖5 各因素對(duì)發(fā)酵綜合評(píng)分的交互作用Fig.5 The interaction effect of various factors on the fermentation comprehensive scores

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)金果梨紫薯混菌發(fā)酵的最佳工藝條件為：乳酸菌接種量1.93%、醋酸菌接種量0.03%、發(fā)酵時(shí)間4.38 d、發(fā)酵溫度32.89 ℃。考慮實(shí)際操作問(wèn)題，將工藝條件修正為:乳酸菌接種量1.9%、醋酸菌接種量0.03%、發(fā)酵時(shí)間4.5 d、發(fā)酵溫度33 ℃。在此條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，綜合評(píng)分為0.833，與理論預(yù)測(cè)評(píng)分0.841誤差較小，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)金果梨紫薯的發(fā)酵工藝，具有實(shí)際參考價(jià)值。

2.3 抗氧化活性

因紫薯中的花青素被釋放到發(fā)酵液中，金果梨紫薯酵素經(jīng)6倍稀釋后對(duì)4種自由基仍具有清除率。由圖6可知，DPPH自由基的清除率為72.66%，ABTS自由基的清除率為82.11%，在同等情況下，0.01 mg/mL的Vc對(duì)上述兩種自由基的清除率分別為57.27%、60.72%。羥基自由基的清除率為73.53%，超氧自由基的清除率為6.60%，在同等情況下，0.2 mg/mL的Vc對(duì)上述兩種自由基的清除率分別為82.26%、71.51%。金果梨紫薯酵素雖對(duì)超氧自由基的清除率較低，綜合評(píng)價(jià)其仍具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖6 金果梨紫薯酵素對(duì)不同自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of Hovenia acerba and purple sweet potato enzyme on different free radicals

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以金果梨紫薯酵母發(fā)酵液為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其混菌發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為乳酸菌接種量1.9%、醋酸菌接種量0.03%、發(fā)酵時(shí)間4.5 d，發(fā)酵溫度33 ℃，產(chǎn)品的綜合評(píng)分可達(dá)到0.833。其總酸度約為15 g/L，低于果醋的國(guó)標(biāo)(25 g/L)，使消費(fèi)者更易接受，且該酵素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，符合將其作為日常飲品的需求。本試驗(yàn)優(yōu)化了金果梨紫薯的混菌發(fā)酵工藝，提高了產(chǎn)品的可接受性，在一定程度上解決了金果梨殘次果問(wèn)題。