陸地棉GhUGT76C1基因克隆、生物信息學分析及功能初探

唐成芬，林文妮，Josee ornella musaniwabo，劉愛玉，屠小菊

(1.湖南農業大學農學院，長沙 410128；2. 湖南農業大學生物科學技術學院， 長沙 410128)

【研究意義】棉花為世界上最重要的經濟作物之一，是紡織工業中最重要的可再生纖維[1]。矮化棉花品種能夠有效提高光能利用率和收獲指數，解決不耐肥的問題，并具有適宜密植及機械化管理、無公害、提高產量、降低勞動強度和節約成本等特點[2]。【前人研究進展】細胞分裂素在擬南芥、水稻等植物中具有調控植物矮化的功能，但是未見與棉花矮化相關的報道。水稻OsAHP1基因和OsAHP2基因RNAi突變體表現出CK信號途徑缺陷和節間長度變小導致矮化的表型[3]。OsCKX4/RootEnhancer1(ren1-D)是CKX同源基因，其顯性突變的植物表現出細胞分裂素水平降低及半矮化表型[4]。OsCKX9介導細胞分裂素降解，其突變體株高降低[5]。OryzasativaVIN3-LIKE2(OsVIL2) 通過與細胞分裂素降解基因OsCKX2的啟動子結合來影響株高和生物量[6]。在擬南芥中，過量表達陸地棉GhDREB1基因會導致擬南芥矮化、晚開花及對細胞分裂素的敏感性降低的表型，這與2個CK信號途徑中的2個關鍵組分type-B和type-A的ARRs抑制表達相關[7]。在植物體內細胞分裂素穩態的復雜過程中，N-葡萄糖基化是調控植物體內細胞分裂素代謝平衡的重要機制之一[8]。UGT76C1基因是細胞分裂素N-糖基轉移酶基因，糖基轉移酶UGT76C1在植物體內可使細胞分裂素發生糖基化修飾并使細胞分裂素失活和參與調控植物對細胞分裂素的響應[6，9]。UGT76C1和UGT76C2能夠催化細胞分裂素形成細胞分裂素 N(7)-葡萄糖苷和N(9)-葡萄糖苷，UGT76C1缺失突變體ugt76C1細胞分裂素N-糖苷的積累顯著降低，而UGT76C1過表達株增加了細胞分裂素N-糖苷的積累，葡萄糖基轉移酶UGT76C1可以通過細胞分裂素的N-葡萄糖基化精細調節植物中的細胞分裂素反應[10]。擬南芥中UGT76C1基因與細胞分裂素的含量有重要關系，在擬南芥UGT家族中，只有UGT76C1、UGT76C2和UGT85A13個基因可使細胞分裂素失活[11]。但是目前未見UGT76C1基因調控植物矮化的報道。【本研究切入點】湖南農業大學棉花研究所前期通過蛋白質組學研究發現，GhUGT76C1基因與陸地棉矮化突變體LA-1的矮化密切相關。本實驗通過克隆陸地棉GhUGT76C1基因并進行生物信息學分析，轉化擬南芥獲得過量表達轉基因株系，并觀察不同光質光強條件下的表型性狀。【擬解決的關鍵問題】為進一步研究GhUGT76C1基因的功能及其與LA-1矮化的相關性奠定基礎，為篩選陸地棉矮化基因及解析陸地棉矮化突變體LA-1矮化的分子機理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陸地棉矮化突變體LA-1材料由湖南農業大學棉花研究所提供。本文用于保存質粒與擴繁的菌種為大腸桿菌DH5α，所用質粒型號為pCUbi1390，用于轉染擬南芥所用菌種為農桿菌GV3101，均為湖南農業大學棉花研究所實驗室保存菌種。RNA提取及逆轉錄試劑盒由SIGMA公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1GhUGT76C1基因克隆 以陸地棉矮化突變體LA-1葉片為材料，采用SIGMA公司RNA提取試劑盒提取總 RNA。將RNA反轉錄成 cDNA，設計引物序列(UGT76C1-F：5′-TGCACTAGGTACCTGCAGATGAAACTGAAGGGTCGTGGATC-3′；UGT76C 1-R：5′-GGATCCGTCGACCTGCAGCATAGAAAGTAT GTAACTAACCAAATTGTC-3′)，進行 PCR 擴增，將PCR產物送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2GhUGT76C1基因生物信息學分析 將克隆得到的GhUGT76C1基因的cDNA序列用NCBI(http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的Blastn和Blastp進行生物信息學分析，使用proparam (https://web.expasy.org/protparam/)在線工具和DNAStar軟件對編碼蛋白的理化性質進行分析，利用SOPMA對陸地棉GhUGT76C1蛋白的二級結構進行預測。在NCBI基因庫中選取不同物種的UGT76C1基因進行序列比對，并選取其cds序列，用MEGAX構建系統發育樹。

1.2.3GhUGT76C1基因過量表達載體構建及轉化農桿菌 將pCUbi1390載體進行Pst1單酶切，使用PCR產物純化試劑盒將酶切產物及克隆得到的PCR產物進行純化，通過連接酶連接并轉化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α，篩選獲得陽性克隆，得到的重組質粒采用液氮凍融法導入農桿菌GV3101感受態中，篩選陽性菌落，并通過菌落PCR驗證，將檢測成功的陽性菌液送北京擎科生物科技有限公司進行測序驗證。

1.2.4GhUGT76C1基因過量表達轉基因株系的篩選及表型分析 利用浸花法將測序成功的農桿菌轉化野生型擬南芥Col-0，并篩選陽性苗，獲得GhUGT76C1過表達轉基因株系。為了研究GhUGT76C1基因在植物生長過程中發揮的作用，將Col-0和GhUGT76C1過表達轉基因株系材料分別放置在黑暗、白光、藍光、紅光及遠紅光下進行培養，光強設置為 0.1、1.0、10.0、30.0 μmol/(m2·s)，6 d后，每個處理取10株擬南芥測量下胚軸長度。

2 結果與分析

2.1 GhUGT76C1基因克隆

以陸地棉矮化突變體LA-1葉片為材料，提取總 RNA，電泳檢測顯示RNA條帶清晰，能夠進行下一步實驗。將RNA反轉錄成 cDNA，用UGT76C1-F和UGT76C1-R引物進行 PCR 擴增，獲得約1400 bp PCR產物(圖1)，測序結果表明，得到1447 bp的片段，在NCBI的BLAST比對中發現，克隆得到的序列與GossypiumhirsutumUDP-glycosyltransferase76C2-like基因(GenBank:XM_016830413.1)序列同源性高達99.77%，表明成功克隆了GhUGT76C1基因。

A: 陸地棉RNA檢測; 1, 2, 3: RNA條帶; B: GhUGT76C1基因克隆; M: DL2000 DNA marker; 1, 2: GhUGT76C1基因擴增產物A: RNA detection of upland cotton; 1, 2, 3: RNA stripe; B: Cloning of GhUGT76C1; M: DL2000 DNA marker; 1, 2: Amplification product of GhUGT76C1 gene圖1 陸地棉RNA提取及GhUGT76C1基因克隆Fig.1 RNA extract from Gossypium hirsutum and cloning of GhUGT76C1

2.2 GhUGT76C1基因的開放閱讀框及理化性質分析

根據陸地棉GhUGT76C1基因cds序列進行開放閱讀框(圖2)分析，序列中有1個最長為1365 bp的開放閱讀框，其中起始密碼子位于1 bp處，終止密碼子位于1365 bp處。使用BLAST和DNAstar等軟件得出的結果一致，推測此開放閱讀框可編碼455個氨基酸。使用proparam在線工具和DNAStar軟件對編碼蛋白的理化性質進行預測，該序列編碼產物的分子式為C4190H7017N1365O1770S286，原子總數為14 628。理論分子量約為 51.31 kD，不存在二硫鍵。理論等電點為5.40，編碼的 454個氨基酸中，組成最多的是Ala，所占比例為5.1%。帶負電荷的殘基總數為52，帶正電荷的殘基總數為40，不穩定系數為44.94，GhUGT76C1基因編碼不穩定蛋白。親水性的平均值(GRAVY)為0.065，為疏水性蛋白。

圖2 陸地棉GhUGT76C1基因序列的ORF分析Fig.2 ORF analysis of GhUGT76C1 gene sequence in Gossypium hirsutum

2.3 陸地棉GhUGT76C1蛋白結構及氨基酸序列同源性比對分析

利用SOPMA對陸地棉GhUGT76C1蛋白的二級結構(圖3)預測，GhUGT76C1蛋白由ɑ-螺旋、無規卷曲、延伸鏈以及β-轉角組成，分別占43.39%，35.68%，13.66%和 7.27%。利用NCBI上的blastp程序檢索同源蛋白，獲取多個物種的UGT76C1 同源蛋白序列(圖4), 物種包括水蜜桃(Prunuspersica,ID: 18786137)、葡萄(Vitisvinifera,ID: 100244489)、小麥(Triticumaestivum,ID: 1004 15862)、花生(Arachishypogaea,ID: 112736258、擬南芥(Arabidopsisthaliana,ID: 821732)、陸地棉(Gossypiumhirsutum,ID:107931078)、黃連苔草(CoptischinensisFranch,ID: 1000500)。利用MEGA構建系統進化樹可以看出陸地棉與擬南芥同源蛋白在進化過程中屬于同一分支，親緣關系最近。

藍色: ɑ-螺旋; 橙色: 無規卷曲; 紅色: 延伸鏈; 綠色: β-轉角Blue: Alpha helix; Orange: Random coil; Red: Extended strand; Green: Beta turn圖3 GhUGT76C1蛋白二級結構Fig.3 Secondary structure of GhUGT76C1 protein

圖4 陸地棉GhUGT76C1蛋白系統發育樹分析Fig.4 Analysis of development tree of Gossypium hirsutum GhUGT76C1 protein system

2.4 陸地棉GhUGT76C1基因過表達載體構建

將GhUGT76C1基因及pCUbi1390載體進行酶切連接，并轉化大腸桿菌E.coliDH5α，挑選陽性克隆進行PCR檢測，結果表明，克隆的基因序列與NCBI基因序列完全一致，說明成功構建了pCUbi1390-GhUGT76C1重組質粒。將得到的重組質粒采用液氮凍融法導入農桿菌GV3101感受態中，菌液PCR鑒定陽性轉化子 (圖5)。其中1、2、3號樣本都成功導入了重組質粒，含有目的基因, 可以直接應用于植物的遺傳轉化。

M: Trans 5K marker;1, 2, 3號為PCR產物M: Trans 5K marker;No.1, 2, 3 is the PCR product圖5 重組質粒菌液PCR檢測Fig.5 Detection of recombinant plasmids by Escherichia coli gel electrophoresis

2.5 不同光質光強處理下GhUGT76C1基因過表達轉基因株系表型分析

黑暗條件下，GhUGT76C1過表達轉基因株系下胚軸長度顯著大于Col-0(圖6)，白光處理條件下，2種材料的下胚軸長度無顯著差異。不同光強度的藍光、紅光、遠紅光處理條件下，GhUGT76C1過表達轉基因株系與Col-0的下胚軸長度存在差異，尤其是在藍光及遠紅光處理條件下，差異較明顯。其中在光強為0.1和1.0 μmol/(m2·s)藍光處理條件下，兩種材料的差異達到顯著水平；0.1 μmol/(m2·s)遠紅光光強處理條件下，過表達轉基因株系下胚軸長度明顯大于Col-0；在不同光照強度紅光處理條件下，過表達轉基因株系的下胚軸長度均大于Col-0，但是差異不顯著。說明GhUGT76C1基因在黑暗及低光強藍光及遠紅光條件下對植株下胚軸生長發揮正調控作用。

A, B, C, D, E分別表示黑暗, 白光, 藍光, 紅光, 遠紅光處理A, B, C, D and E represent dark, white, blue, red, and far-red processing，respectively圖6 黑暗、白光及不同光質處理下突變體下胚軸長度Fig.6 Hypocotyl length of mutants treated with dark, white and different light quality

3 討 論

自1922年Parnell發現矮化水稻后，60多種矮化的水稻被檢測出來[12]。另外，在小麥、玉米、大豆及甘藍型油菜等多種作物上均發現了不同種類的矮化突變體[13-16]。目前，關于矮化突變體的研究主要集中在植物激素調控矮化方面，包括植物形態、細胞學和激素調控矮化的機理研究等[17]。研究表明，多數植物矮化突變體都是激素合成途徑或者應答調節發生突變使植物莖的生長發育發生改變造成的[18]，主要與植物赤霉素(GA)和油菜素類固醇(BR)有關，少數與其他激素相關[19]。細胞分裂素能夠調控植物生長和發育的各個方面，包括細胞分裂、芽的萌發和分化、種子發育等，在植物生長中發揮極其重要的作用[20]。

目前，關于細胞分裂素N-糖基轉移酶基因研究的報道較少，更未見該基因調控陸地棉株高的研究。本研究在前期蛋白質組學研究的基礎[21]上，篩選得到的GhUGT76C1基因可能與陸地棉矮化突變體LA-1的矮化相關。并克隆獲得約1400 bp PCR產物，在NCBI的BLAST比對中發現，克隆得到的序列與GossypiumhirsutumUDP-glycosyltransferase76C2-like基因(GenBank:XM_016830413.1)序列同源性達99.77%。生物信息學分析發現其序列中有一個最長為1365 bp的開放閱讀框，編碼455個氨基酸。并對GhUGT76C1基因的理化性質、二級結構等進行了深入的分析，本研究首次成功克隆了陸地棉GhUGT76C1基因。

葡萄糖基轉移酶 UGT76C1 能夠對 N(7)-和 N(9)-位置的不同細胞分裂素進行 N-葡萄糖基化，最早在擬南芥中被發現，擬南芥中UGT76C1基因調控細胞分裂素在植物體內的含量，在細胞分裂素代謝途徑中，udp-糖基轉移酶通過細胞分裂素的糖基化，對細胞分裂素進行修飾，對維持細胞正常的生理活動有極其重要的作用[6]。但是還未見關于UGT76C1基因調控植物株高的研究。本研究通過構建GhUGT76C1基因的過量表達載體，并轉化擬南芥獲得了轉基因株系。通過對轉基因株系的表型分析發現，黑暗及較低強度的藍光和遠紅光處理條件下，UGT76C1基因過表達突變體下胚軸長度均大于Col-0。研究表明，不同激素之間可以通過相互作用調節植物生長。MsGH3.5的過表達可以顯著增加植物體內CK含量，降低游離IAA含量，導致突變體表現出明顯的矮化表型[22]。黑暗誘導的生長的主要特征是下胚軸的快速伸長，植物中ABA 缺乏導致下胚軸生長減少，外源ABA可恢復生長，ABA通過增強編碼細胞周期蛋白依賴性激酶 SlKRP1 和 SlKRP3 抑制劑的基因的表達以及降低細胞分裂素水平來促進 DNA 核內復制從而導致下胚軸的增長[23]，在黑暗及不同的弱光照處理條件下，GhUGT76C1基因過量表達是否通過使CK失活，導致GhUGT76C1過量表達轉基因株系ABA含量增加，從而使其下胚軸較長，GhUGT76C1是否通過調控不同激素之間的含量變化，從而引起株高表型差異，還有待進一步的研究。

4 結 論

本研究成功克隆了陸地棉GhUGT76C1基因，基因全長1447 bp，cds序列1365 bp，編碼454個氨基酸，成功構建了陸地棉GhUGT76C1基因過量表達載體，并轉化擬南芥獲得過量表達轉基因株系，過量表達轉基因株系在黑暗、低光強藍光及遠紅光條件下均出現顯著的下胚軸增長的表型。