87份水稻材料中抗稻瘟病基因的分子檢測

劉軍化，黃成志，蔣靜玥，呂直文，劉忠賢，蔡鐘亞，雷樹凡

(1. 重慶三峽農業科學院，重慶 萬州 404155；2. 重慶三峽學院，重慶 萬州 404020)

【研究意義】稻瘟病又稱稻熱病，系水稻常見病害之一，是由稻瘟病菌Magnaportheoryzae引起的世界性水稻真菌病害。稻瘟病在全球廣泛發生，其生理小種分布廣且多變，每年造成的水稻減產在10%～30%，嚴重時能夠達到50%以上，還會降低稻米食味品質，影響口感[1-2]，嚴重阻礙水稻產業的可持續發展。目前，稻瘟病的防治方法主要有推廣應用抗病新品種、采用生物防治和化學防治等。前兩者投入周期長，且因稻瘟病生理小種變異迅速和頻繁，抗病品種種植3～5年后就喪失了抗性，防治效果不太理想；而大量使用化學農藥防治，常會造成植物體內農藥殘留超標和環境污染，威脅生態環境和食品安全[3-5]。相比傳統選育手段存在耗時長、易出現目標抗性基因錯選或漏選等缺點，分子輔助育種可以有針對性地選擇抗性基因，能更加便捷、高效地培育稻瘟病抗性新品種。因此發掘稻瘟病抗性基因，利用分子輔助選擇培育抗稻瘟病的水稻新品種，是稻瘟病防治的基本策略之一[6]。【前人研究進展】稻瘟病抗性基因的挖掘是解析水稻抗病分子機理的重要途徑。目前報道的稻瘟病抗性基因已有100個左右[7-8]，已克隆的基因約有30個[9]。由于這些抗性基因的表達、來源及植株生長環境的不同，水稻材料具有高度多樣性和變異性等特點，增加了稻瘟病抗性基因的多樣性，豐富了育種家選育的優良稻瘟病抗性新品種[10]。單一抗性基因的長期利用會造成抗病能力逐年減弱，直至喪失抗性；而利用聚合基因選育的新品種抗病能力則表現出了較好的穩定性。前人通過分子標記法對多基因的抗性表達進行研究，得出有些基因聚合能使水稻抗性增強，如廣譜抗性基因Pi9為主效基因時，同時聚合Pi-ta和Pi-b基因可以持久提高水稻的抗病能力[11]；但也有研究表明導入基因Pi21會減弱水稻的抗病能力[12]；抗性表達需要聚合抗性強的主基因，后期多次回交和自交才能消除其與稻瘟病抗性間的不利連鎖反應，因此有針對性地進行基因間的聚合研究是非常有必要的[13]；同時，因抗性基因的時限性與不確定性，且病菌群易發生變異，長期使用單一R基因進行抗病育種是不可取的，會導致產生新的病菌群，原有效抗性基因會失去抗性[14]。因此，多方面深入研究抗性基因聚合與抗病等級的相關性，引進多樣的抗性資源和探索新的抗性基因，合理布局和輪換使用抗稻瘟病品種，是減輕稻瘟病危害的有效途徑[15]。【本研究切入點】稻瘟病抗性基因的分子標記是水稻抗病育種的有效手段，但稻瘟病菌生理小種具有高度變異性，為了應對抗性變化，針對性地利用抗性基因改良品種抗性，育種工作者需要了解材料或品種本身的田間稻瘟病抗性及基因型分布，避免育種工作的盲目性。因此，本研究利用Pi1[16-17]、Pib[18-19]、Pi2[20-21]、Pi5[22-23]、Pi9[21,24]、Pita[25-26]、Pigm[27]、Pik[28-29]、Pik-m[30-31]9個稻瘟病主效抗性基因功能性分子標記，結合PARMS SNP分型技術，對87份水稻資源進行基因型分析，探明水稻種質資源抗性表達與基因型之間的相關性，精準選擇所需要的稻瘟病抗性育種材料。【擬解決的關鍵問題】綜合87份水稻材料的稻瘟病田間鑒定及抗性基因分子檢測結果，分析稻瘟病抗性基因分布對水稻大田葉瘟、穗頸瘟發病程度的影響，為篩選水稻抗性資源提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻材料為重慶三峽農業科學院水稻研究室多年選育而成。

1.2 試驗地點

試驗點選取重慶市萬州區甘寧鎮永勝村(108.24°E、30.67°N)、湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市白果鄉兩河口村(109.22°E、30.17°N)、貴州省湄潭縣興隆鎮廟塘壩村(107.30°E、27.40°N)3個稻瘟病抗性鑒定基地。

1.3 試驗方法

1.3.1 稻瘟病抗性鑒定 2021年3月中旬在萬州區甘寧鎮常規育秧，5月中旬移栽至甘寧鎮、白果鄉稻瘟病抗性鑒定基地，對照品種為麗江黑谷；6月上旬和9月中旬分別調查其葉瘟和穗頸瘟發病情況，葉瘟按照五點抓取法對所選區域病葉的病斑大小進行分級，穗頸瘟調查按照2021年國家區試方案和《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程》[32]進行。湄潭縣興隆鎮試驗點的水稻種植及稻瘟病抗性鑒定委托湄潭縣植保站進行。

1.3.2 DNA提取 綜合分析甘寧和恩施兩點的水稻穗頸瘟鑒定結果，選擇恩施點稻瘟病抗性基地中稻瘟病抗性在中抗及以上的水稻材料87份，取其劍葉，編號，裝在2 mL離心管中，放入加有冰袋的泡沫箱中密封。采用CTAB法提取劍葉中的DNA[33]。

1.3.3 分子標記分析 采用PARMS SNP分型技術(景肽生物科技有限公司)，根據PARMS master mix說明書配置10 μL PCR反應體系(表1)，PCR擴增反應條件如表2所示。分子特異性標記引物由景肽生物科技有限公司提供。

表1 PCR擴增反應體系

表2 PCR擴增反應條件

1.3.4 熒光顯色 PARMS采用FAM和HEX作為報告熒光，ROX作為參比熒光，可在具有3種熒光檢測通道的酶標儀及定量PCR儀中進行快速檢測，A點接FAM(藍色熒光)，若檢出是純合基因，在分型圖上顯藍色，輸出結果為FAM；C點接HEX(綠色熒光)，若檢出是純合基因，在分型圖上顯綠色，輸出結果為HEX，若是雜合基因，在分型圖上顯紅色，輸出結果為FAMHEX；灰色的是沒有擴增信號的點(圖1)。PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶標儀讀取熒光信號，利用在線軟件Snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析轉換熒光信號，得到清晰直觀的分型圖，并根據顏色不同，輸出基因型結果。

#1. Allele 1 FAM熒光通用引物；#2. Allele 2 HEX 熒光通用引物；#3. Allele 1 特異擴增引物(標記引物)；#4. Allele 2 特異擴增引物(標記引物)；#5. Locus 特異擴增引物(標記引物)#1. Allele 1 FAM fluorescent universal primers; #2. Allele 2 HEX fluorescent universal primers; #3. Allele 1 specific amplification primer (marker primer); #4. Allele 2 specific amplification primer (marker primer); #5. Locus specific amplification primer (marker primer)圖1 PARMS SNP檢測原理Fig.1 PARMS SNP detection principle

2 結果與分析

2.1 稻瘟病抗性鑒定

2.1.1 葉瘟抗性等級調查 3個試驗點的水稻葉瘟抗性鑒定結果(圖2)：萬州點抗病等級為1級的水稻材料有21份，2級材料有36份，3級材料有30份；恩施點抗病等級為1級材料有1份，2級材料有23份，3級材料有63份；湄潭點抗病等級為1級材料有0份，2級材料有22份，3級材料有41份，4級材料有24份。分析3個試驗點的葉瘟抗病等級，發現在萬州本地篩選出的抗病水稻材料，其抗性在恩施市白果鄉和湄潭縣興隆鎮表現出逐漸減弱的趨勢。

圖2 87份水稻材料的葉瘟抗病等級Fig.2 Disease resistance grades to leaf blast in 87 rice materials

2.1.2 穗頸瘟抗性等級調查 3個試驗點的水稻穗頸瘟抗性鑒定結果(圖3)：萬州點抗病等級為1級材料有40份，3級材料有47份；恩施點抗病等級為1級材料有16份，3級材料有52份，5級材料有19份；湄潭點抗病等級為5級材料有14份，7級材料有60份，9級材料有13份。綜合分析，萬州點和恩施點材料的抗性等級多數在中抗及以上，或因兩個地區的地理位置相近和生態環境相似，導致稻瘟病生理小種致病性相近；而湄潭點材料在中感病以后，基本喪失了對稻瘟病的抗性。

圖3 87份水稻材料的穗頸瘟抗病等級Fig.3 Disease resistance grades to panicle blast in 87 rice materials

2.2 稻瘟病抗性基因檢測

利用TECAN infinite M1000酶標儀讀取熒光信號，得到9個稻瘟病抗性基因Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m的分型圖(圖4)。根據分型圖顏色不同，解析轉換熒光信號，輸出基因型檢測結果(表3)。在87份水稻材料中，未檢測到9個抗性基因的材料有2份，檢測到單基因的材料有10份，含2個聚合基因的材料有31份，3個聚合基因的材料有33份，4個聚合基因的材料有10份，5個聚合基因的材料有1份。9個稻瘟病抗性基因分布情況，含有Pi1基因的材料有4份，占比4.60%；含有Pib基因的材料53份(雜合基因材料5份)，占比60.92%；含Pi2基因的材料有47份(雜合基因材料9份)，占比54.02%；含Pi5基因的材料有72份(雜合基因材料5份)，占比82.76%；含Pi9和Pik基因的材料0份；含Pita基因的材料36份(雜合基因材料8份)，占比41.38%；含Pigm基因的材料有14份(雜合基因材料3份)，占比16.09%；含Pik-m基因的材料有21份，占比24.14%。綜合抗性分析，萬州區甘寧鎮和恩施市白果鄉的地理位置和生態環境相近，稻瘟病生理小種的致病性相近，表現出的抗性結果也相近；而湄潭縣興隆鎮的地理位置和生態環境不同，所選材料對該點生理小種的抗病能力減弱。結果表明，中感病(MS)材料有52份，占比59.77%；感病(S)材料有22份，占比25.29%；高感病(HS)材料有13份，占比14.94%。

A. Pi1檢測結果；B. Pib檢測結果；C. Pi2檢測結果；D. Pi5檢測結果；E. Pi9檢測結果；F. Pita檢測結果；G. Pigm檢測結果；H. Pik檢測結果；I. Pik-m檢測結果。“綠色點”表示感病純合基因；“藍色點”表示抗病純合基因；“紅色點”表示雜合基因；“灰色點”表示該基因無擴增信號點A. Pi1 test results；B. Pib test results；C. Pi2 test results；D. Pi5 test results；E. Pi9 test results；F. Pita test results；G. Pigm test results；H. Pik test results；I. Pik-m test results.‘Green dot’ indicates susceptible homozygous gene; ‘Blue dot’ indicates disease resistance homozygous gene; ‘Red dot’ indicates heterozygous gene; ‘Gray dot’ indicates that the gene has no amplification signal point 圖4 9個抗性基因的熒光掃描分型Fig.4 Fluorescence scanning fractal of 9 resistance genes

表3 87份材料的抗性基因熒光解析結果及綜合抗性

續表3 Continued table 3

續表3 Continued table 3

3 討 論

試驗重點檢測9個稻瘟病抗性基因Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m在水稻稻瘟病抗性材料中的分布情況。Pi1、Pik、Pik-m基因連鎖位于第11號染色體長臂末端，Pi1對水稻葉瘟病抗性具有較強作用[34]；Pik是主效抗稻瘟病基因，對國內許多稻瘟病生理小種有穩定的、較強的抗性[28]；Pik-m是Pik的等位基因，在中國南方稻區具有廣泛的抗性[29]。Pib位于第2號染色體長臂末端，在日本表現出廣泛抗性，對中國的菌株ZB13和ZC15也表現抗病反應[18]。Pi9與Pi2、Pigm位于第6號染色體Piz位點的復等位基因，Pi9與Pi2的抗譜相當廣，對大多數國家的稻瘟病生理小種表現出抗性[21]。Pigm是一個廣譜抗稻瘟病基因，比公認的廣譜抗性基因Pi1、Pi2、Pi3的抗譜更廣[35-36]。Pi5位于第11號染色體，是識別稻瘟病效應子AVR-CO39所必需的，遺傳分析表明只有RGA5-A具有抗性[22]。Pita位于第12號染色體，是稻瘟病抗性基因成簇分布的熱點區域之一[26]；范方軍等[37]利用分子標記檢測64份水稻品系，結果表明抗稻瘟病基因Pi-ta與穗頸瘟發生程度之間存在顯著相關性。

在供試87份水稻材料中，未檢測到這9個抗性基因分布的材料有2份，檢測到單基因分布的材料也很少，僅有Pi5分布的材料有6份，僅有Pi2分布的材料有2份，Pita和Pik-m分布的材料各1份；多數材料至少含2個聚合基因，最多的含有5個聚合基因。研究表明，稻瘟病抗性基因的分布與葉瘟、穗頸瘟發病程度之間沒有明顯的規律，有的材料雖然基因分布相同，但其表現出的稻瘟病抗病等級不同，可能是這些材料中含有未被檢測到的稻瘟病抗性基因在發揮作用，需要進一步檢測驗證；此外也揭示了水稻對稻瘟病的抗性并不因聚合的抗性基因越多而越強，可能是稻瘟病抗性基因的抗性隨著稻瘟病生理小種的變異而減弱，今后應加大對稻瘟病抗性新基因的挖掘與應用。

4 結 論

綜合分析萬州點、恩施點和湄潭點水稻材料的稻瘟病田間抗性鑒定結果及9個抗性基因分布檢測結果，可以明確這些基因在三峽庫區仍保留對部分稻區中稻瘟病生理小種的抗性，且對葉瘟的抗性較穗頸瘟更強，但其抗性優勢有減弱的趨勢。因此在今后的稻瘟病抗性品種選育中，引進稻瘟病廣譜抗性強的新資源和挖掘新的抗性基因，是選育抗稻瘟病新品種的有效途徑。