煙株根圍土壤中膠凍樣芽孢桿菌解鉀能力研究

雷晶晶，高 可，康業斌，趙世民，苗 圃

(1.河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471023；2 河南省煙草公司洛陽市公司，河南 洛陽 471023)

【研究意義】在我國農田土壤耕層中儲藏著大量的鉀、磷、氮等營養元素，其中鉀元素的平均含量為26 100 kg/hm2[1-2]。然而，這些鉀元素存在于各種固態的巖石中，不能以鉀離子的形態存在土壤中，從而不能被植物根系吸收利用，造成目前農田管理中經常遇到的土壤富鉀而植物生長缺鉀的情況。因此，為了提升植物的質量需要提高土壤中的可溶性鉀含量，需要多途徑多方面解決植物缺鉀問題。【前人研究進展】在煙株生長過程中普遍出現缺鉀現象，缺少鉀元素會導致煙葉邊緣和煙葉前端下卷，葉片軟塌，不平整，出現黃綠色或紅銅色暈斑、棕褐色壞點。嚴重缺鉀時煙葉葉肉退綠，葉片邊緣枯黃破損，導致煙草大量減產，給煙農帶來經濟損失[3]。研究表明，鉀、氮、磷元素已成為了影響農作產量與質量的三個重要元素[4]。提高土壤耕層中植物可直接吸收利用的鉀含量，促進植物生長發育已經成為目前高效利用土壤營養元素的研究熱點之一。目前，當煙草生產過程中大面積出現缺鉀現象時，煙農經常采用直接在土壤中拌入鉀肥或者將含有鉀的化學品制成溶液噴施在葉片，達到預防煙株缺鉀或快速補鉀的目的[5-6]。然而，這種直接在土壤中追肥和葉面噴施鉀溶液的方式會使土壤板結、土質酸化、微生物類群失衡，這些不良情況的發生會導致煙株感染土傳病害的情況加重，影響煙草的品質，增加煙草的生產成本。其中亞歷山大羅夫[7]將能夠分解硅酸鹽礦物中鉀元素的細菌命名為膠質芽孢桿菌或膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，在國內研究中經常稱其為鉀細菌[8-9]。郭玲玲等[10]通過在相同土壤中加入不同質量的鉀長石粉并接入相同數量的解鉀菌，檢測解鉀菌的數量變化來初步分離篩選獲得具有較高解鉀活性的解鉀細菌，分離出的菌株比實驗室保存菌種K02的解鉀效率高3.6倍，比菌種K01高13倍。韓曉陽等[11]將山東茶園土壤中得到的最強解鉀效率的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K2制成微生物菌劑。地施該微生物菌劑后土壤中有效鉀和有效磷含量顯著提高，比對照分別提高28.40%和28.49%，茶葉產量提高36.30%，為開發適合山東茶園土壤環境的專用微生物菌劑提供相關參考。李華等[12]通過紫外線誘導膠凍樣芽孢桿菌基因突變得到2株誘導菌株，使其比原始菌株的解鉀能力分別提高1282.35%，1909.80%。【本研究切入點】目前，關于我國煙田尤其是洛陽煙田煙株根圍土壤中解鉀菌的報道很少，因此需要針對洛陽煙田土壤環境研發專用的微生物菌劑解離土壤中的固態鉀。【擬解決的關鍵問題】本研究開展洛陽煙田煙株根圍土壤中解鉀菌的相關分析，為解決洛陽煙田鉀肥供需矛盾，增加洛陽煙葉的產量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品：2017年7—9月，在河南省洛陽市小界鄉徐村、大坪鄉宋嶺、楊莊村三地植煙區，根據煙田實際面積，隨機5點取樣，每點選擇5株健康煙株，在煙株莖稈基部一側去除表層0～5 cm的土壤，用鐵鏟挖出15～20 cm帶根土壤。用小刀將距根系2 mm以上的土壤輕輕剝離，抖落剩余土壤作為根圍土壤樣品進行收集。將采回的根圍土壤樣品在通風處進行自然晾干，去除小石塊等雜質。剩余土樣經研缽研磨后過2 mm孔徑的篩子(10目)，用四分法留樣并編號(表 1)。

表1 煙株根圍土壤樣品基本信息

培養基：硅酸鹽細菌分離培養基[13]，NA培養基，淀粉水解培養基，明膠液化培養基，M.R試驗培養基，V-P試驗培養基，鹽培養基，石蕊牛乳培養基，糖醇發酵培養基，酸鹽還原培養基，休和賴夫森二氏培養基用于細菌的生理生化鑒定[14-15]。

標準菌株：購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號23575。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與純化 土壤解鉀細菌的分離采用稀釋涂布平板法。將處理好的土樣加入無菌水制成系列濃度梯度的懸浮液，均勻涂布到硅酸鹽細菌篩選培養基平板上，將其放入28 ℃恒溫培養箱中培養3 d。每個處理重復5次。待菌落長出，選擇無污染，細菌菌落分散相對均勻的3個平板，從中挑出與標準菌株23575菌落形態特征相似，即無色透明、半玻璃狀并富有彈性的菌落進行下一步純化試驗，將菌株接種到液體NA培養基中在28 ℃、170 r/min條件下持續震蕩過夜培養，將所得菌液稀釋適當濃度后涂布于固體培養基平板上，28 ℃恒溫培養24 h后，重復上訴步驟至平板上菌落一致后，轉接至NA平板上，28 ℃培養72 h后，4 ℃保存備用[16]。

1.2.2 細菌鑒定 (1)形態學鑒定。待測菌株純化后接種在NA平板上，28 ℃培養72 h，待長出單一菌落后，平板觀察待測菌落的大小、凸起形狀、菌落邊緣、透明程度、顏色、粘稠度等形態特征。革蘭氏染色后，在光學顯微鏡下觀察菌體及芽孢的形態[17-18]，記錄所有菌株的相關數據。

(2)生理生化鑒定。按照常規的細菌生理生化鑒定方法對初步篩選出的菌株進行厭氧性、耐鹽性、對不同碳源的利用等一系列生理生化試驗，以膠凍樣芽孢桿菌標準菌株作為對照，觀測其生理生化特性。

(3)16S rDNA序列分析。選擇菌株形態特征，生理生化反應與標準菌株完全一致的待測菌株在NA平板上活化培養48 h后，通過細菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA，送往上海生物工程(上海)有限公司測序。將待測菌株序列與已登記的解鉀菌基因序列進行同源性比較，使用MEGA 6軟件將目標序列及其同源性高的序列構建系統發育樹[19]。

1.2.3 細菌解鉀能力測定 依據GBT 8574—2010 復混肥料中鉀含量測定(四苯硼酸鉀重量法)[20]進行解鉀能力的測定。本試驗解鉀能力測定原理為：在以鉀長石為唯一鉀源的待測發酵菌液中加入四苯硼酸鈉溶液，使其與鉀離子充分結合形成四苯硼酸鉀沉淀，所得沉淀恒溫干燥冷卻后稱重。統計數據結果，分析供試菌株的解鉀能力。

(1)種子液的制備。將發育良好的解鉀菌菌落接種到種子液中搖培，使每瓶菌體含量大概2.0×108CFU/mL。

(2)發酵液的制備。每瓶加入液體培養基95 mL，鉀長石粉使用前，用20%的鹽酸溶液消耗表面的游離鉀和交換性鉀。

(3)分別吸取菌體含量2.0×108CFU/mL左右的種子液5 mL加入對應編號的發酵液中。以未接待測菌的種子液作為空白對照，在搖床中培養7 d。

(4)用過氧化氫試劑對發酵液進行灰化處理，使待測液不再粘稠。3500 r/min，離心10 min后收集上清液，用蒸餾水定容至50 mL。

(5)在潔凈的培養皿的底部寫下編號，在培養皿中各放一張孔徑0.45 μm的混和濾膜，用天平各稱量3次，記錄數據，備用。

(6)在處理后的試液中逐滴加入四苯硼酸鈉溶液，不停地攪拌，直至不再產生沉淀，再過量加入7 mL四苯硼酸鈉溶液，持續攪拌，使四苯硼酸鈉與試液中的鉀離子充分結合，靜置15 min，濾膜過濾。

(7)計算數據，將步驟(6)得出的數據減去步驟(5)得出的數據，得出沉淀的質量。

(8)數據分析。鉀離子含量越多沉淀質量越大，即該菌株的解鉀能力越強。

2 結果與分析

2.1 菌落形態及革蘭氏染色反應

從河南省洛陽市嵩縣、汝陽、洛寧3個縣煙草不同生育期的煙田根圍土壤樣品分離獲得14個純菌株，其中菌株001、003、005、006、007、008、011、012、013的菌落呈圓形、白色或乳白色、透明、邊緣整齊、表面光滑凸起、呈粘稠狀，革蘭氏染色反應呈陽性，菌體為桿狀，表觀特征與標準菌株23575相似；菌株002、004、009、010、014在菌落粘稠性等方面與標準菌株不一致(表2)。

表2 菌株形態學與革蘭氏染色觀察

2.2 生理生化特性檢測

選取待測菌株中表觀特征與標準菌株23575相似的9個菌株進行生理生化檢驗，菌株001、005、006、007、008、011、012為兼性厭氧性細菌，與過氧化氫酶反應陽性，可使水解淀粉、糖醇發酵、硝酸鹽還原，V-P測定與M.R測定均顯示陽性，在石蕊牛乳試驗反應中均可以產酸，不能使明膠液化，且能利用檸檬酸鹽，生理生化反應特性與標準菌株完全一致；菌株003、013在糖醇發酵與牛奶固化方面與標準菌株不同(表3)。

表3 菌株生理生化反應

2.3 16S rDNA序列分析

將菌株001、003、005、006、007、008、011、012、013的序列提交至GenBank數據庫，所得基因登錄號分別為MN227330、MN227332、MN227334、MN227335、MN227336、MN227337、MN227340、MN227341、MN227342。將待測菌株的序列在NCBI上比對后，結果(圖1)表明，菌株005、008的16S rDNA 序列與GenBank數據庫中登錄號為EU048557、HM579819、DQ898309的膠凍樣芽孢桿菌的同源性高于99%。根據菌株的形態特征、生理生化特性并結合16S rDNA序列分析結果，將菌株005與008鑒定為膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)。

圖1 菌株16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed by strains 16S rDNA gene sequence

2.4 菌株005和008的解鉀能力

菌株005、008與標準菌株23575的平均沉淀質量分別為0.140、0.136、0.166 g，均大于對照組(0.046 g)，說明標準菌株23575與待測菌株005和008都具有解鉀能力；采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，結果(表4)表明，菌株005、008與標準菌株23575的平均沉淀質量差異顯著(P<0.05)。

表4 菌株005、008和23575的解鉀能力方差分析

3 討 論

本研究分離獲得2株具有較強解鉀能力的細菌，初步檢測其解鉀能力，為研發具有解鉀功效的微生態制劑奠定了基礎。本試驗利用硅酸鹽細菌培養基，從河南省洛陽市嵩縣、汝陽、洛寧3個縣煙草不同生育期的煙田根圍土壤樣品分離獲得純菌株14個，通過復篩和16S rDNA序列分析鑒定出菌株005、008為解鉀菌中的膠凍樣芽孢桿菌，均為兼性厭氧性細菌，與過氧化氫酶反應為陽性，可使淀粉水解、糖醇發酵、硝酸鹽還原，在石蕊牛乳試驗反應中均可以產酸，不能使明膠液化，且能利用檸檬酸鹽。這與石禹等[21]進行幾株硅酸鹽細菌的系統發育分析的方法基本一致。試驗中菌株005、008在對鉀長石為原料的解鉀能力測定結果中不如標準菌株解鉀效果顯著，關于待測菌株的解鉀測定，本試驗采用四苯硼酸鈉測定法，該方法的試驗原理是首先依據控制變量原則將所有待測菌株在種子液中培養到對數期(菌體含量大概2.0×106CFU/mL)，在同等菌量、同等礦石量的條件下比較菌株的解鉀能力。吳凡等[22]從桑樹根際土樣中分離獲得29株解鉀細菌，解鉀能力測定顯示，解鉀菌效率最高達到41.79%。趙飛等[23]從山東地區不同植物根際土壤中初篩到 23 株生長勢良好的解鉀菌，利用火焰分光光度計計算鉀含量，發酵液中鉀含量增加25.4%和29.8%。因此，由于環境和生態演化機制的不同，處于不同生境中的分離菌，其釋鉀能力也存在著明顯差異。解鉀菌的解鉀能力也受解鉀菌的種類、礦物類型和礦物含量等方面的影響[24-25]。可以通過優化菌株的培養條件來提高鉀菌的解鉀能力，也可通過改變含鉀礦物的硬度或粒度、解鉀過程中的pH、解鉀菌的基因量的表達等方面探究提高解鉀菌的解鉀能力，為植物利用有效鉀提供更多的研究方向，解鉀菌生物肥可耐受各種不良的環境條件，容易儲存、便于運輸、大規模生產、工藝簡單、成本較低，在微生物肥料工業生產中越來越受到人們的重視和歡迎。但從農業生產的實際情況和功能菌株在國內外農業上的應用現狀來看，雖然解鉀菌的解鉀功能對植物的生長有利無害，但解鉀菌在農田產生解鉀效果的作用周期長、解鉀效能容易受土壤環境的影響，無法提高煙農的經濟效益。因此篩選出具有高效穩定解鉀活性的解鉀菌株，是目前解鉀菌研究的主要方向。

研究表明，有的解鉀菌雖破壞鉀長石釋放可溶性鉀的能力顯著，但其在農田土壤中的解鉀絕對量卻十分有限[26]。許成悅等[27]利用芝麻餅及牛糞作為基質，將解鉀菌接種在2種基質上發酵，干燥制成菌肥，結果表明加入解鉀菌的芝麻餅及牛糞基質能夠促進河南省駐馬店泌陽縣地區煙草下層側根的生長，可能增加煙株的根系體積、株高和煙葉的數量。因此，本試驗所分離鑒定得到的膠凍樣芽孢桿菌通過試驗證明是生產生物鉀肥的理想菌株，可為進一步通過基因工程技術和改良鉀肥基質等方法來提高菌種在實際生產中的解鉀活力和解鉀穩定性提供相關試驗基礎，為微生物肥料的開發應用提供相關的試驗經驗。

4 結 論

本試驗從河南省洛陽市嵩縣、汝陽、洛寧3個縣不同生育期的煙株根圍土壤樣品中分離獲得14株硅酸鹽細菌，均為陽性、桿狀細菌。依據14個菌株的厭氧性以及對不同碳源、檸檬酸鹽的利用等生理生化反應特征，結合16S rDRNA序列比對分析結果，將菌株005、008鑒定為膠凍樣芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，隸屬于細菌域，厚壁菌門，芽孢桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。解鉀能力測定表明，菌株005、008均具有較強的解鉀能力，可為進一步開發具有解鉀功能的生物有機肥提供相關的理論基礎和菌種資源。