間充質(zhì)干細(xì)胞治療嚴(yán)重燙傷的研究進(jìn)展

楊仁生，龐榮清

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

燙傷是指由沸水、蒸汽等熱力所致的組織器官損傷，是常見(jiàn)且復(fù)雜的創(chuàng)傷疾病之一[1]，是嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。燙傷可損傷皮膚，嚴(yán)重燙傷往往引發(fā)機(jī)體全身炎癥反應(yīng)，甚至因多器官功能障礙綜合征(multi-organ dysfunction syndrome，MODS)而導(dǎo)致死亡[3]。目前，嚴(yán)重燙傷的主要治療策略是抗休克治療、抗感染治療、皮膚創(chuàng)面修復(fù)治療以及維持器官功能的對(duì)癥支持治療[4]，但療效不佳。一方面，這些治療方法在皮膚修復(fù)中難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)闆](méi)有合適的皮膚可以移植，且難以保證移植成功[5]；另一方面，這些治療方法與嚴(yán)重燙傷后的病理生理變化相互矛盾[6]。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展為嚴(yán)重燙傷治療帶來(lái)新的希望[7-10]。因此，研究探索MSC調(diào)節(jié)嚴(yán)重燙傷引發(fā)的免疫功能紊亂[10]、修復(fù)皮膚創(chuàng)面[5]和組織[11]的技術(shù)方法及其作用機(jī)制顯得十分緊迫。現(xiàn)就MSC治療嚴(yán)重燙傷的研究進(jìn)展予以綜述，通過(guò)分析燙傷模型的選擇與MSC治療結(jié)合綜合考慮研究方案的必要性，展望借助高通量技術(shù)方法深入開(kāi)展MSC治療嚴(yán)重燙傷系列研究的前景。

1 燙傷MODS的病理生理機(jī)制

皮膚由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，包括血管、毛囊和汗腺等附屬物[12]，是機(jī)體將外部環(huán)境與內(nèi)部器官分開(kāi)的重要屏障。當(dāng)皮膚受到嚴(yán)重燙傷后，一方面，熱力效應(yīng)直接破壞皮膚組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致組織滲透性增加，大量液體滲出，循環(huán)血量明顯減少，引起器官組織缺血缺氧，導(dǎo)致肺、肝等主要器官的功能障礙和損害[13]；同時(shí)，嚴(yán)重燙傷會(huì)引起全身應(yīng)激性反應(yīng)，尤其是胃腸道的應(yīng)激性損傷，造成黏膜組織細(xì)胞的變性、壞死、脫落，直接破壞胃腸道黏膜屏障功能[14]，微生物趁機(jī)移位進(jìn)入血液循環(huán)，形成腸源性的內(nèi)毒素血癥[15]。腸源性的內(nèi)毒素血癥是嚴(yán)重燙傷后導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因之一。另一方面，大面積燙傷后，若不進(jìn)行手術(shù)治療，創(chuàng)面持續(xù)存在，殘留的壞死組織及大量滲液為皮膚表面的大量微生物異常生長(zhǎng)提供了良好條件，當(dāng)創(chuàng)面上的微生物達(dá)到一定濃度時(shí)，微生物趁機(jī)侵襲機(jī)體焦痂深層，并不斷侵襲鄰近的健康組織，導(dǎo)致嚴(yán)重外源性感染[16]。可見(jiàn)，嚴(yán)重燙傷本質(zhì)上是局部直接組織損傷并發(fā)遠(yuǎn)端多器官組織炎性損傷。其主要病理生理機(jī)制是毛細(xì)血管網(wǎng)通透性增加，激活機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)[17]，釋放大量應(yīng)激激素和炎癥介質(zhì)，逐步發(fā)展為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”或“瀑布效應(yīng)”[18-19]。在此基礎(chǔ)上，內(nèi)外源性感染發(fā)生，微生物及其細(xì)菌毒素進(jìn)入血液循環(huán)形成菌血癥或膿毒癥，機(jī)體在兩次打擊下極易引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至發(fā)展為MODS[3]。

由此可見(jiàn)，機(jī)體受到嚴(yán)重燙傷后，從皮膚損傷到MODS是一個(gè)不斷發(fā)展演變遞進(jìn)的過(guò)程。研究觀察嚴(yán)重燙傷后的病理生理發(fā)展變化規(guī)律，針對(duì)關(guān)鍵發(fā)展環(huán)節(jié)，探索延緩或阻斷某個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的發(fā)展進(jìn)程，最大限度地減輕、延緩或阻止嚴(yán)重燙傷后引起的免疫功能紊亂、緩解臟器功能損傷，有可能降低以MODS為病理生理特征的急危重癥患者的死亡率。因此，從燙傷引起的MODS發(fā)病機(jī)制出發(fā)，以某個(gè)關(guān)鍵發(fā)展環(huán)節(jié)為切入點(diǎn)，深入探討嚴(yán)重燙傷的干細(xì)胞治療策略具有非常重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值[20-21]。

2 MSC在嚴(yán)重燙傷治療中的應(yīng)用

MSC是一類起源于中胚層，具有自我更新和多向分化潛能的不成熟細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪、臍帶和胎盤(pán)等器官或組織中分離獲取[22]。眾多干細(xì)胞生物學(xué)研究證實(shí)，MSC不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ、CD40和CD80等共刺激分子[12,23-24]，即MSC具有低免疫原性，可以異體甚至異種移植用于臨床治療。MSC可抑制淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)[25]，直接抑制淋巴細(xì)胞增殖，還可分泌多種活性因子參與免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)[26]，從而減輕炎癥反應(yīng)，避免了由糖皮質(zhì)激素抗炎治療引發(fā)的機(jī)體免疫功能紊亂和抗生素治療導(dǎo)致的機(jī)體腸道菌群的異位和失調(diào)，從而加重機(jī)體的感染；同時(shí)MSC還具有歸巢和分化功能，促進(jìn)皮膚組織和臟器組織修復(fù)，從而恢復(fù)臟器功能[27]。MSC的這些獨(dú)特生物學(xué)特性使得異體移植MSC治療嚴(yán)重燙傷成為可能。

2.1基于全身免疫調(diào)節(jié)的MSC治療 雖然MSC對(duì)機(jī)體燙傷的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚，但目前普遍認(rèn)為MSC主要依賴于細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸或旁分泌免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)兩種方式來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，MSC可使巨噬細(xì)胞從炎癥的M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)性抗炎M2表型[4,7-8]，使傷口產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10][7]，減少促炎性細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子-α)[9]。另一研究也顯示，MSC治療燙傷模型可以持續(xù)減少炎癥細(xì)胞因子(高遷移率族蛋白B1、IL-6和腫瘤壞死因子-α)的生成，而增加抗炎性細(xì)胞因子(IL-10)的生成[10]。說(shuō)明MSC至少具有通過(guò)以IL-10為核心的平衡途徑正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷微環(huán)境中，促炎性細(xì)胞因子可以刺激MSC分泌一氧化氮、前列腺素E2和吲哚胺2,3-雙加氧酶等介質(zhì)[28]，通過(guò)影響免疫細(xì)胞的增殖及分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和前列腺素E2可抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，抑制輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)0分化為Th1細(xì)胞，促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制自然殺傷細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等促炎免疫細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等抗炎免疫細(xì)胞的增加[12,29-30]。MSC的這些調(diào)節(jié)作用中有一個(gè)重要的作用機(jī)制是可以調(diào)節(jié)p38促分裂原活化的蛋白激酶和核因子κB P65 蛋白的磷酸化水平，在燙傷中可激活肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞，MSC可以在嚴(yán)重燙傷下通過(guò)分泌腫瘤壞死因子-α刺激基因6，從而減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)[10]。

根據(jù)嚴(yán)重燙傷的病理生理進(jìn)展，結(jié)合MSC生物學(xué)功能方面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用MSC的免疫調(diào)節(jié)功能治療嚴(yán)重燙傷是可行的，但目前的研究主要表明MSC治療起到了調(diào)節(jié)免疫功能的作用，并揭示了部分作用機(jī)制，迫切需要在掌握嚴(yán)重燙傷后病理生理發(fā)展變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步廣泛研究MSC的免疫調(diào)節(jié)作用及其更全面的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，尤其應(yīng)該注意負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制研究。以此為切入點(diǎn)，從免疫調(diào)節(jié)療效角度深入探索MSC的體外預(yù)處理方案以及細(xì)胞治療的時(shí)機(jī)和細(xì)胞治療劑量對(duì)燙傷治療的影響，有望最大限度地糾正嚴(yán)重燙傷后免疫功能失衡。這可以在一定程度上延緩或阻止機(jī)體全身炎癥反應(yīng)甚至預(yù)防MODS的發(fā)生，從而降低嚴(yán)重燙傷患者的死亡率[31]。

2.2基于外泌體的MSC治療 MSC除了分泌多種活性因子及介質(zhì)外，還能分泌外泌體發(fā)揮生物學(xué)作用。外泌體是一種由真核細(xì)胞的多泡體與胞膜融合后釋放到胞外的納米級(jí)膜性小囊泡[32]，其作為信號(hào)分子載體，可以在不同細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞及細(xì)胞大分子間的傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，將生物分子傳遞到受體細(xì)胞發(fā)揮多種生物學(xué)功能[33]。MSC能夠通過(guò)外泌體將巨噬細(xì)胞暴露于微RNA來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，這些RNA結(jié)合到免疫細(xì)胞中并抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌。然后通過(guò)免疫細(xì)胞之間的這些微RNA的交換來(lái)傳遞信息，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[34]。同時(shí)，MSC來(lái)源的外泌體還可以促進(jìn)傷口的血管生成素2上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)損傷區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管能力，從而促進(jìn)血管生成，加快傷口愈合[35]。MSC的免疫調(diào)節(jié)作用與分化修復(fù)作用并不是孤立存在的，如MSC釋放的外泌體除了促進(jìn)血管生成，還可通過(guò)極化M2型巨噬細(xì)胞來(lái)減輕黏膜炎癥，維持小鼠腸道結(jié)構(gòu)的完整性[36]。可見(jiàn)，外泌體是MSC臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的延伸。外泌體遠(yuǎn)小于MSC，大劑量使用不會(huì)導(dǎo)致肺栓塞，更重要的是可以制成注射液，目前已經(jīng)有外泌體直接注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、口服給藥和基于水凝膠的包埋研究，已經(jīng)被用來(lái)治療不同的疾病模型[37]。在戰(zhàn)爭(zhēng)條件下，燃燒彈、火焰噴射器等武器的使用更易集中出現(xiàn)大量嚴(yán)重傷病員，MSC來(lái)源的外泌體注射液的成功開(kāi)發(fā)，使得野戰(zhàn)條件下使用成為可能。

2.3基于組織修復(fù)的MSC治療 MSC治療嚴(yán)重燙傷的另一個(gè)重要機(jī)制是干細(xì)胞的分化和修復(fù)功能。基礎(chǔ)研究表明，移植進(jìn)入體內(nèi)的MSC可以在趨化因子的引導(dǎo)下靶向遷移到燙傷創(chuàng)面及機(jī)體組織中定植，在特定微環(huán)境條件下分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，如皮膚細(xì)胞等[2,38]。有研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)MSC靶向遷移的是炎癥組織中的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1，呈梯度分布的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1會(huì)引導(dǎo)更多的MSC向受損部位遷移[9,12]，并分化為功能組織細(xì)胞以替代受損細(xì)胞[12]。MSC可通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌多種生長(zhǎng)因子和誘導(dǎo)因子，激活機(jī)體原位干細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)傷口快速愈合[9]。同時(shí)，MSC還可分泌乳酸鹽，使巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)性抗炎M2型巨噬細(xì)胞，從而增加抵抗素樣分子α和整合素(CD11b)的表達(dá)，其中抵抗素樣分子α可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)展，促進(jìn)新生血管的生成和成肌纖維細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)傷口的愈合[39]；CD11b可誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)，通過(guò)多途徑調(diào)節(jié)傷口炎癥反應(yīng)，并通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖抑制長(zhǎng)時(shí)間炎癥引起的皮膚纖維化[40]，從而抵御外界病原微生物的侵入，預(yù)防炎癥進(jìn)一步加重。此外，MSC還廣泛參與腸[36]、肺[41]和肝[25]等器官損傷修復(fù)，并通過(guò)修復(fù)組織器官緩解內(nèi)源性感染，促進(jìn)皮膚愈合預(yù)防外源性細(xì)菌侵入機(jī)體進(jìn)一步加重全身炎癥反應(yīng)。因此，開(kāi)展MSC修復(fù)嚴(yán)重燙傷組織研究，需要復(fù)制不同損傷程度的模型，并開(kāi)展不同途徑的細(xì)胞給藥比較研究。

3 基于MSC治療需求的燙傷動(dòng)物模型選擇

從上述分析可知，開(kāi)展MSC治療燙傷研究必須首先建立一個(gè)穩(wěn)定、規(guī)范化、符合臨床要求的燙傷動(dòng)物模型。從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特點(diǎn)來(lái)看，豬的皮膚組織結(jié)構(gòu)和生化指標(biāo)與人極其相似[1，20]，體型大小也更適于皮膚移植的手術(shù)操作，但實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高，且難以大批量復(fù)制模型用于細(xì)胞劑量篩選等研究。小鼠個(gè)體太小，血管太細(xì)，而MSC直徑較大，當(dāng)靜脈輸注MSC進(jìn)入血管時(shí)，細(xì)胞數(shù)量稍多易造成梗死，不太適于開(kāi)展MSC靜脈輸注治療研究。因此，燙傷動(dòng)物模型最常用大鼠和兔[42-44]。

從MSC治療實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)看，利用金屬棒[45-48]直接接觸動(dòng)物皮膚造成局部皮膚不同程度損傷的方法簡(jiǎn)便易行，容易精準(zhǔn)控制燙傷作用時(shí)間、創(chuàng)面形狀和面積，便于批量復(fù)制燙傷動(dòng)物模型，但因?yàn)榻饘贍C頭與皮膚之間容易導(dǎo)致致傷壓力不均、局部高溫容易造成表皮凝固性壞死而不利于熱力效應(yīng)向深層傳播、金屬燙頭容易快速降溫，故這類局部燙傷的動(dòng)物模型均一性不好，不易誘發(fā)全身應(yīng)急性損傷，較適于小樣本局部皮膚創(chuàng)面修復(fù)的治療觀察研究。直接接觸熱水致傷的方法[29，39]容易控制水溫，但不好控制燙傷皮膚的形狀和面積，且水溫最高100 ℃，易導(dǎo)致表皮凝固性壞死，不利于熱力效應(yīng)向深層傳播，同樣相對(duì)不易誘發(fā)全身應(yīng)急性損傷。而蒸汽溫度遠(yuǎn)超100 ℃，即便在海拔1 890 m的昆明地區(qū)也可高達(dá)110 ℃，且熱力效應(yīng)穿透力極強(qiáng)，蒸汽作用時(shí)間極易精準(zhǔn)控制，特別容易造成大面積皮膚深度損傷，如果輔以特定的蒸汽產(chǎn)生裝置和特定的皮膚保護(hù)模具[7]，很容易短時(shí)間內(nèi)批量制備不同創(chuàng)面大小或不同燙傷程度的均一燙傷模型，很容易誘發(fā)局部組織變性壞死和全身性炎癥反應(yīng)，特別適于開(kāi)展局部皮膚組織MSC修復(fù)治療、MSC系統(tǒng)性預(yù)防和治療效果評(píng)價(jià)以及治療機(jī)制研究，同時(shí)獲得的模型也可用于研究觀察MSC生存演變規(guī)律。

回顧MSC治療燙傷的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果不適合進(jìn)行比較，因?yàn)橹谱鳡C傷模型差異較大，如熱水致傷大鼠模型水溫差異太大，故動(dòng)物模型病理生理變化差異也很大。因此，在開(kāi)展MSC治療燙傷研究時(shí)，應(yīng)充分考慮不同制備方法獲得的燙傷動(dòng)物模型的病理生理變化特點(diǎn)、將動(dòng)物模型制備與MSC治療方案結(jié)合起來(lái)綜合考慮設(shè)計(jì)研究方案，如研究MSC預(yù)防或治療嚴(yán)重燙傷引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)時(shí)，只有選擇蒸汽致傷這類致傷嚴(yán)重的模型，才能模擬從皮膚損傷到MODS的過(guò)程，也才能探索延緩或者阻斷某個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)展進(jìn)程的切入點(diǎn)，在構(gòu)思科研立項(xiàng)時(shí)，才能找準(zhǔn)需要解決的科學(xué)問(wèn)題，也才更有利于從不同角度深入推進(jìn)MSC治療嚴(yán)重燙傷的系列研究。事實(shí)上，目前MSC治療燙傷的研究，最需要的就是基于從皮膚損傷到MODS的動(dòng)態(tài)發(fā)展變化規(guī)律的認(rèn)識(shí)、借助各種高通量檢測(cè)分析技術(shù)手段開(kāi)展的非現(xiàn)象觀察的深層次研究，有望理清嚴(yán)重燙傷引發(fā)的免疫功能紊亂以及MSC調(diào)節(jié)的十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制和因果關(guān)系，以為將來(lái)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4 小 結(jié)

MSC在嚴(yán)重燙傷中發(fā)揮重要作用，可以利用其生物學(xué)功能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面血管新生、促進(jìn)創(chuàng)面愈合。鑒于目前嚴(yán)重燙傷的治療效果尚不滿意的現(xiàn)狀，結(jié)合嚴(yán)重燙傷的病理生理變化特點(diǎn)，充分運(yùn)用MSC基礎(chǔ)研究的最新成果，建立合適的動(dòng)物模型研究開(kāi)發(fā)嚴(yán)重燙傷等以MODS為病理生理特征的急危重癥治療新技術(shù)具有重要意義。但是MSC的輸入途徑、劑量、時(shí)間仍需要明確，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步了解MSC的功能及其機(jī)制，以為臨床治療嚴(yán)重燙傷提供理論依據(jù)。