細胞外囊泡在骨關節(jié)炎中作用及治療研究進展

章川，李松軍

(遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院骨一科，廣東 珠海 519100)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成以及滑膜炎癥為特征的退行性關節(jié)疾病，可導致疼痛、畸形和關節(jié)功能障礙。臨床治療主要包括藥物療法、物理療法和手術療法，以及其他基于緩解疼痛的綜合療法，但上述治療僅能夠一定程度緩解疼痛，改善關節(jié)功能，無法從根本上逆轉膝關節(jié)進一步退變的進程。近年來，細胞外囊泡(extracellular vesicies，EVs)在組織工程和再生醫(yī)學領域的研究進展引起了廣大學者的極大關注，并成為再生醫(yī)學中控制炎癥、修復損傷、促進再生等研究的新領域[1]。EVs包括外泌體(exosome，Exo)、微囊泡和凋亡小體，是細胞分泌傳遞生物信號的納米級細胞間信使。EVs在OA軟骨形成和軟骨再生中具有潛在作用，源自軟骨細胞的EVs可在體外誘導祖細胞和干細胞分化為成熟的軟骨細胞，這被認為是修復軟骨損傷最有希望的治療方法[2-3]。EVs還可提高抗炎和免疫調節(jié)細胞因子水平，并降低炎癥細胞因子水平，因此，應用來自間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的EVs治療OA具有巨大潛力[4]。目前已知EVs在OA中具有一系列生理功能和病理作用，但其促進關節(jié)修復和減緩關節(jié)退行性病變的機制尚不完全清楚。現(xiàn)對EVs在OA中作用及治療的研究進展予以綜述。

1 EVs的定義及分類

EVs是異質雙層脂質膜小泡的統(tǒng)稱，直徑通常為30～2 000 nm，其可作為各種生物活性信號分子的載體介導細胞間通信作用，已經成為研究疾病和組織修復的熱點[5]。EVs是含有多種生物活性的分子，包括蛋白質、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)、脂肪和DNA。根據直徑和生物起源途徑可將EVs分為Exo、微囊泡和凋亡小體[6-7]。Exo是最小的EVs，直徑30～150 nm，由多泡核內體產生并隨著隔室和質膜的融合而釋放。微囊泡(既往稱為微粒)直徑50～1 000 nm，其可直接從質膜脫落，與Exo相似，微囊泡可能包含核酸、蛋白質和脂質，且可以將上述信號分子轉運至靶細胞。凋亡小體是目前已知的直徑最大的EVs，直徑超過1 000 nm，在細胞凋亡后期形成[8]。EVs可通過不同的機制與受體細胞進行交流，如通過跨膜蛋白與細胞表面受體相互作用，從而誘導細胞內信號通路，亦可通過與細胞膜直接融合或內吞作用釋放到靶細胞中。未來仍然需要深入了解EVs的生物分子機制，以更好地標記不同類型的EVs。

2 EVs在OA中的作用

2.1EVs在OA中的診斷潛力 EVs是OA病理學和病理生理學的新型生物標志物。OA軟骨與正常軟骨的蛋白質含量存在差異，主要由于OA軟骨中細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分的變化。正常人群關節(jié)軟骨囊泡的ECM含量遠高于OA患者，其中包括Ⅱ型膠原、蛋白多糖、雙糖鏈蛋白聚糖，故推測ECM破壞可能使OA患者上述相關蛋白減少，因此可從分子生物學角度對上述蛋白的含量進行檢測，從而更準確地認識OA早期病變。

此外，OA的早期干預可延遲或防止早期OA的進一步發(fā)展。EVs作為關鍵的miRNA載體，對細胞間信息交流有重要作用，EVs-miRNA可作為OA的早期診斷標志物。miR-140在軟骨細胞中高表達，對調節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，OA患者的miR-140表達遠低于正常人群[9]。miR-335-5p是OA保護性基因，可能在OA中發(fā)揮重要作用，何偉珍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，OA患者的miR-335-5p水平低于正常人群。miR-155是一種自噬相關miRNA，在OA中呈高表達，其通過調節(jié)自噬相關蛋白的表達抑制OA軟骨細胞自噬[11]。

與miRNA相似，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)不僅是OA的潛在生物標志物，還參與了OA的病程。不同lncRNA可以靶向多種miRNA，如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13、Toll樣受體4、Janus激酶，進而影響軟骨細胞增殖、ECM降解及炎癥反應[12]。lncRNA前列腺癌基因表達標記1(prostate cancer gene expression marker 1，PCGEM1)被認為是OA不同階段的指標。研究顯示，晚期OA滑膜液中Exo lncRNA PCGEM1的表達明顯高于早期OA，表明滑膜中的Exo lncRNA PCGEM1可能是區(qū)分早期和晚期OA的有力指標[13]，這為準確診斷OA奠定了重要基礎，并提升了分子水平上OA診斷的準確性，有助于對疾病進展做出更加精準的判斷，并針對其分子水平變化制訂治療方案。

2.2EVs在OA中功能 EVs可以進入軟骨細胞、成纖維樣滑膜細胞和巨噬細胞[14-17]。在膝關節(jié)中，軟骨細胞、成纖維樣滑膜細胞和巨噬細胞通過滑液內EVs的相互作用，在OA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[18-19]。EVs不通過被動擴散侵入細胞，其可被白細胞介素(interleukin，IL)-1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等炎癥介質激活，常用于模擬關節(jié)炎環(huán)境的細胞培養(yǎng)實驗。此外，OA滑膜細胞周圍透明質酸基質的存在也可以促進EVs的內化，表明透明質酸基質外膜可作為EVs的天然載體[20]。有學者發(fā)現(xiàn)，EVs以多種方式影響成纖維樣滑膜細胞和軟骨組織。免疫細胞來源的EVs誘導了軟骨降解蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13)和炎癥介質(IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白1、單核細胞趨化蛋白2)在OA患者滑膜成纖維細胞中的合成[21]。關節(jié)軟骨組織中的關節(jié)軟骨囊泡可作為病理性鈣鹽晶體沉積形成病灶[22]。與人滑膜成纖維細胞來源的Exo相比，IL-1β來源的Exo刺激人滑膜成纖維細胞顯著上調關節(jié)軟骨細胞MMP-13和解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5的表達，下調Ⅱ型膠原α1和聚蛋白聚糖的表達[23]。用OA滑液產生的EVs治療正常關節(jié)軟骨細胞可降低細胞存活和合成代謝基因(COL2、聚蛋白聚糖)的表達，增加TNF-α的表達，并提高MMP-2和MMP-9的活性[24]。Song等[25]研究發(fā)現(xiàn)，來源于OA的Exo可使正常軟骨細胞增殖減少、凋亡增加。老年患者OA軟骨細胞產生的EVs增加，這些EVs能夠將衰老特征傳遞給鄰近細胞，并減少前列腺素的產生[26]。此外，EVs可激活免疫細胞，OA患者滑膜細胞來源的Exo使M1型巨噬細胞釋放細胞因子(IL-1β、IL-16)、趨化因子(CC趨化因子配體15、CC趨化因子配體20)和MMP(MMP-7、MMP-12)增加，在OA發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵性作用[27]。

膝關節(jié)OA患者滑液來源的Exo可促進淋巴細胞趨化，抑制軟骨細胞增殖[28]。EVs對關節(jié)組織結構的不利影響很多，但也有積極作用。中性粒細胞來源的EVs可激活軟骨細胞合成代謝基因COL2A1、SOX9的表達，通過轉化生長因子-β誘導ECM沉積和軟骨保護，減少IL-8和前列腺素E2釋放以及軟骨細胞凋亡[15]。在小鼠模型中，正常條件下培養(yǎng)的原代軟骨細胞來源的Exo能夠延緩OA的惡化，還可誘導巨噬細胞向抗炎M2型巨噬細胞的極化[29]。在體外實驗中，Exo通過增加細胞活力、增強COL2和聚蛋白聚糖表達以及減少MMP-13和解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5的表達，延緩IL-1β誘發(fā)的軟骨退化，并可恢復線粒體功能。此外，來源于M2型巨噬細胞的Exo可刺激原代軟骨細胞中COL2A1和聚蛋白聚糖的表達[30]。且富血小板血漿來源的Exo可增加經IL-1β處理原代軟骨細胞的增殖和遷移，減少軟骨細胞的凋亡和TNF-α的釋放[31]。

3 EVs在OA治療中的應用

目前OA的主要治療是減輕疼痛、改善關節(jié)功能，治療方案包括手術治療及非手術治療。對輕度至中度膝關節(jié)OA患者，一般選擇非手術治療，主要包括鎮(zhèn)痛、減重、理療等。對于非手術治療無效的晚期OA患者，可采用手術治療，包括脛骨高位截骨術、人工關節(jié)置換術、關節(jié)鏡下清理術等。MSC具有旁分泌作用，可合成和分泌多種生長因子，而趨化因子和細胞因子可以極大地影響其相鄰細胞，同時MSC可分泌多種類型的EVs，如微囊泡和Exo。EVs具有緩解疼痛、抑制炎癥、減緩軟骨破壞的作用，未來 EVs聯(lián)合自噬相關藥物可能是治療OA的重要方法。

3.1緩解疼痛并抑制炎癥 目前，非甾體抗炎藥和物理療法是緩解OA疼痛的主要治療方法，且兩者聯(lián)用效果更佳。He等[32]對碘乙酸鈉誘導大鼠OA模型的研究顯示，骨髓MSC來源Exo關節(jié)內注射可有效促進軟骨修復和ECM合成，減輕膝關節(jié)疼痛，其中降鈣素基因相關蛋白質水平降低是疼痛減輕的重要因素。Li等[33]的研究顯示，骨髓MSC-Exo可通過消除腰椎小關節(jié)OA小鼠模型腰椎小關節(jié)軟骨下骨中異常的降鈣素基因相關肽陽性神經和異常的H型血管形成來減輕疼痛；此外，骨髓MSC-Exo可減輕軟骨退變，抑制抗酒石酸酸性磷酸酶表達和核因子κB受體活化因子配體-核因子κB受體活化因子-TNF受體相關因子6信號通路激活，促進軟骨下骨重塑，表明骨髓MSC-Exo可以緩解腰痛的行為體征和腰椎小關節(jié)OA的病理過程。可見，血管生成的減弱以及軟骨下骨骨侵蝕的減少是緩解腰椎小關節(jié)OA疼痛的主要原因，骨髓MSC-Exo可能是腰椎小關節(jié)OA的潛在治療方案。

炎癥與OA的發(fā)生和發(fā)展有關，損傷的軟骨通過釋放免疫細胞分泌的促炎性細胞因子(如IL-1、IL-8和MMP)引發(fā)炎癥反應，導致軟骨中ECM破壞[34-35]。因此，早期預防和抑制關節(jié)軟骨破壞是阻斷炎癥聯(lián)級反應、緩解OA疼痛癥狀的重要目標，但大部分試驗尚處于體外實驗研究階段。來自不同干細胞的EVs對OA炎癥有明確的治療作用。EVs對軟骨細胞有保護作用，Tofio-Vian等[36]將脂肪組織來源的MSC中分離出的EVs進行標記，發(fā)現(xiàn)其可減少TNF-α、IL-6、前列腺素E2和一氧化氮等炎癥介質的產生，并增強MMP的活性，發(fā)揮抗炎作用。另有研究表明，EVs與活化的滑膜成纖維細胞共培養(yǎng)可下調促炎標志物的表達，并保護關節(jié)軟骨細胞免于凋亡[37]。Vonk等[3]的研究表明，當與OA軟骨細胞共培養(yǎng)時，人骨髓源性MSC分泌的EVs可抑制TNF-α介導的環(huán)加氧酶2和IL的上調，并可在體外促進軟骨再生。Woo等[38]研究顯示，巨噬細胞極化可抑制炎癥反應，M1型巨噬細胞極化表達大量的促炎介質，如TNF-α、IL-12和IL-1β，MSC分泌的EVs可抑制RAW264.7細胞中促炎性細胞因子(環(huán)加氧酶2、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達，并促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的極化。由此可見，EVs可能在OA的抗炎及減輕疼痛管理中具有重要的應用潛力。

3.2促進軟骨再生與修復 在OA進展中，軟骨損傷及缺失逐漸加重，導致疼痛癥狀和功能障礙越來越嚴重，目前晚期OA階段的軟骨損傷修復仍是臨床OA治療的重大挑戰(zhàn)，EVs可抑制炎癥反應、促進軟骨細胞合成代謝，在OA治療中發(fā)揮重要作用。OA中的炎癥和氧化應激作用導致ECM和軟骨細胞破壞和丟失，因此軟骨細胞數(shù)量以及ECM生物合成的增加可減少OA相關并發(fā)癥的發(fā)生。Tao等[39]對miR-155-5p高表達的滑膜MSC-Exo治療OA的效果進行研究，結果表明，在體外不損害ECM分泌的情況下，滑膜MSC-Exo可增強軟骨細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，并在一定程度上預防OA。Wong等[40]對外科手術誘發(fā)的兔軟骨缺損模型進行研究顯示，MSC-Exo與透明質酸聯(lián)用的效果較單獨使用透明質酸更好，且能夠在12周后誘導持續(xù)的軟骨修復。Zhang等[41]的研究證實，向手術誘發(fā)的膝關節(jié)軟骨缺損大鼠關節(jié)內注射MSC-Exo，12周后軟骨和軟骨下骨完全恢復，且修復軟骨組織可與相鄰軟骨組織完全融合。

除促進軟骨細胞增殖外，EVs還具有誘導軟骨細胞分化的潛力。Chen等[42]將軟骨祖細胞-海藻酸鹽植入小鼠皮下后，將從軟骨細胞中提取的Exo移植到被植入部位，植入后12周，大量膠原在穩(wěn)定的軟骨組織中沉積，提示Exo可促進軟骨形成。Zhu等[43]比較滑膜MSC分泌的Exo與誘導多能干細胞來源的MSC分泌的Exo對OA軟骨損傷的療效，結果顯示，誘導多能干細胞來源的MSC分泌的Exo和滑膜MSC分泌的Exo均可刺激軟骨細胞分化，且誘導多能干細胞來源的MSC分泌的Exo治療OA的效果更佳。Wu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，髕下脂肪墊干細胞來源Exo可延緩關節(jié)軟骨退變、抑制細胞凋亡、增強基質合成、降低體外分解代謝因子表達、提高軟骨細胞自噬水平，有助于維持軟骨穩(wěn)態(tài)。綜上，EVs在軟骨形成過程中具有重要作用，并可進一步提高EVs軟骨的形成效率，但差異表達的EVs在軟骨形成和軟骨修復中的作用仍需更多體內外研究的確定。

4 小 結

EVs在OA發(fā)病、進展及治療中發(fā)揮關鍵作用，未來在EVs用于OA的轉化研究和治療干預時，可根據現(xiàn)有的診斷和治療進行評估。EVs可通過提高細胞活力、促進細胞增殖來抑制炎癥，誘導組織修復和再生，并預防OA進一步惡化。理論上，EVs可以傳遞與其親代細胞相同的信號，與直接細胞移植相比，EVs提供了更簡單、更安全、更實用、更易控制的解決方案。目前，EVs研究仍處于早期階段，且大多來源于細胞培養(yǎng)，但相關研究仍有一些問題有待明確：①EVs的類型、數(shù)量、細胞來源；②EVs在各種關節(jié)組織中的穩(wěn)定性及其在軟骨組織中的運輸；③EVs的細胞識別及內化機制。基于EVs在OA治療中顯示出的研究及應用潛力，未來需要更多研究評估EVs在OA治療過程中的確切機制。