Hippo信號通路中YAP/TAZ在骨肉瘤中的研究進展

馬小雨，戴澤宇，鐘南哲，肖建如

(上海長征醫院骨腫瘤外科，上海 黃浦 200003)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤，好發于四肢長骨干骺端，惡性程度高，預后較差。目前骨肉瘤的標準治療原則為手術切除聯合化療(包括阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑和異環磷酰胺)，術后5年的生存率約為70%。但是，40%的患者會出現局部復發和遠處轉移，而轉移后5年的生存率不到20%[1]。目前，骨肉瘤仍存在復發、轉移、耐藥等諸多問題，治療效果不理想，迫切需要新的治療策略[2]。

Hippo信號通路是一條由一系列蛋白激酶、轉錄因子、轉錄共激活因子及其他調控分子構成的生長抑制通路，通過級聯蛋白磷酸化調控細胞信號，調節腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和分化，在腫瘤的發生中發揮著重要作用[3]。Hippo通路的核心分子包括哺乳動物STE20樣蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2)、大型腫瘤抑制激酶1/2(large tumor suppressor 1/2，LATS1/2)、薩爾瓦多家族含WW結構域蛋白1(salvador homologue 1，SAV1)、Mob激酶激活因子1A/B(MOB kinase activator 1 A/B，MOB1A/B)、轉錄調節因子Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)或含PDZ結合基序的轉錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)。Hippo信號通路的作用主要由YAP/TAZ決定，與具有TEA域的轉錄增強因子(TEA domain family member，TEAD)等結合，促進基因轉錄[3]。本文對Hippo信號通路中YAP/TAZ在骨肉瘤中的研究進展進行綜述，希望為骨肉瘤的治療提供更廣闊的思路。

1 YAP/TAZ的結構和功能

YAP和TAZ是Hippo信號通路中的核心效應蛋白，在組織中廣泛存在并在許多腫瘤細胞中表達上調[4]。研究發現，YAP和TAZ蛋白約50%的氨基酸序列同源，且結構非常相似。YAP和TAZ主要由TEAD結構域(轉錄激活因子結合結構域)、WW結構域(雙色氨酸結構域)、TAD結構域(轉錄激活結構域)、PDZ結合基序構成[5]。TEAD結構域識別TEAD轉錄因子家族并激活靶基因表達，如CTGF和Cyr61基因；WW結構域結合PPxY基序(脯氨酸/脯氨酸/任何氨基酸/酪氨酸)介導蛋白質相互作用；TAD結構域可與特定的基因結合，啟動特定基因的轉錄；PDZ結合基序是與許多跨膜或細胞骨架相關蛋白的PDZ域結合所必需的[5]。YAP/TAZ缺少DNA結合結構域，無法直接與DNA結合，因此作為共激活轉錄因子參與基因的表達調控。

當Hippo信號通路激活時，YAP/TAZ發生磷酸化，滯留在細胞質中，或經泛素化途徑降解，抑制細胞增殖；當Hippo信號通路被抑制時，未磷酸化的YAP/TAZ進入細胞核，與轉錄因子TEAD1-4結合，驅動細胞增殖和遷移相關基因的表達[4-5]。YAP和TAZ功能上大多相似，通過影響細胞增殖、轉移、自噬、代謝重編程和免疫微環境，促進腫瘤形成和轉移[4]。但YAP和TAZ也有特異性的靶因子，因此兩者的功能并不完全相同[5]。

2 YAP/TAZ在骨肉瘤中的表達及預后

骨肉瘤仍缺乏有效的診斷和預后標志物，YAP/TAZ具有成為分子標志物的潛力。組織芯片染色證實60%～85%的人類骨肉瘤樣本中可見YAP高表達[6-8]，并且高級別骨肉瘤中的YAP表達水平更高，提示YAP表達與骨肉瘤Enneking分期相關[6]。Zucchini等[8]發現YAP細胞核表達陽性和陰性的骨肉瘤患者出現轉移事件發生率為53%和36%，提示YAP核陽性與骨肉瘤轉移發生相關。Zucchini等[8]進一步將YAP核陽性分為高表達和低表達/不表達，生存曲線顯示YAP在細胞核中的高表達顯著降低骨肉瘤患者的無復發生存時間和總生存期。另一項研究也報道，YAP高轉錄水平與骨肉瘤患者較差的預后顯著相關[9]。因此，YAP高表達的患者預后更差，并且YAP核陽性與骨肉瘤高級別、復發及轉移顯著相關，可協助判斷預后情況。

TAZ在骨肉瘤中的研究較少。Ma等[10]發現，81.25%的骨肉瘤組織中TAZ強陽性，且腫瘤組織中TAZ轉錄活性明顯高于對照組。另一研究[11]報道TAZ在47例骨肉瘤中的陽性表達率為59.6%，與骨肉瘤的遠處轉移及腫瘤Enneking分期有關。目前認為，YAP/TAZ高表達水平與總生存率相關，且YAP/TAZ細胞核陽性表達患者的預后更差，提示YAP/TAZ細胞核陽性表達可能是骨肉瘤的獨立危險因素[12]。

3 YAP/TAZ在骨肉瘤中的作用機制

3.1 驅動腫瘤發生 骨肉瘤的發生機制很復雜，其中YAP/TAZ的調節異常可能發揮重要作用。研究認為腫瘤抑制蛋白P53的突變會影響間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化，并導致骨肉瘤的啟動[13]。在正常條件下P53調節成骨和破骨分化以防止骨腫瘤的發生，而Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)的過表達可抑制P53的功能[14]。在MSCs中，TAZ的過表達激活RUNX2，使其表達上調，促進成骨分化過程[15]。但是，YAP與RUNX2相互作用抑制COL10a1或Sox9表達，從而抑制軟骨細胞的成熟與分化[16]。這表明YAP/TAZ的調節異常可能與MSCs分化異常密切相關。Chan等[7]激活成骨細胞中Hedgehog信號通路，在P53雜合子小鼠中建立骨肉瘤模型，發現所得腫瘤中YAP高表達，進一步抑制YAP表達顯著降低了該模型中骨肉瘤細胞的致瘤潛力，提示YAP的過表達可能在驅動骨肉瘤的發生中發揮重要作用。

3.2 促進腫瘤增殖 YAP/TAZ的持續激活會促進骨肉瘤細胞增殖。Zucchini等[8]發現抑制小鼠骨肉瘤模型的YAP活性后，骨肉瘤細胞的體外增殖降低。Yang等[17]發現YAP在人骨肉瘤細胞系中高表達，而敲低YAP表達可降低骨肉瘤細胞增殖能力，阻滯細胞周期，并抑制小鼠體內移植瘤生長。YAP在骨肉瘤中的表達可通過轉錄后修飾來調節，研究已經證明了多種MicroRNA通過增加YAP的表達和活性導致骨肉瘤的進展，例如miR-375增加YAP的活性[18]、miR-624-5p使YAP入核增多[19]，促進骨肉瘤細胞增殖，而miR-625抑制YAP的功能導致骨肉瘤細胞增殖抑制[20]。此外，人類白細胞抗原F介導轉錄因子10(human leukocyte antigen F-associated transcript 10，FAT10)是一種泛素樣蛋白，在骨肉瘤組織和細胞中高表達，且與YAP表達水平存在顯著的正相關[21]。研究發現FAT10可通過調節泛素化和蛋白酶體介導的降解來穩定YAP蛋白，從而促進骨肉瘤細胞增殖[21]。研究表明YAP促進骨肉瘤細胞系增殖的過程中，TEAD起到關鍵作用。Chai等[22]發現YAP/TEAD1復合物上調促增殖基因PTGS2和CYR61，促進骨肉瘤細胞增殖等多種惡性表型。

3.3 影響腫瘤轉移 轉移是骨肉瘤患者預后不佳的一個重要原因，而YAP/TAZ可能影響轉移相關的過程。上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞表型向間充質細胞表型轉化的現象，可導致細胞間黏附性降低，細胞極性消失，腫瘤細胞形態改變并獲得遷移和侵入的能力。Shen等[23]研究發現在兩種骨肉瘤細胞系U2OS和HOS中敲減TAZ后，細胞的侵襲和遷移能力下降，上皮標志物E-cadherin表達增加，而間充質標志物N-cadherin、Vimentin、Snail表達均減少，表明敲減TAZ可抑制骨肉瘤細胞系的EMT樣轉變；而過表達TAZ可逆轉這一現象，提示TAZ可能通過促進EMT從而加速骨肉瘤的轉移。研究還發現TAZ/TEAD直接激活miR-135b，可能抑制LATS1/2和GSK3β表達，介導EMT發生[23]。此外，細胞系中YAP的敲除抑制了骨肉瘤細胞遷移和侵襲[6，17]，而抑制小鼠骨肉瘤模型的YAP活性后，骨肉瘤細胞的體外增殖、遷移和體內肺轉移能力降低[8]，提示YAP也與轉移發生相關。Luu等[24]認為YAP和TAZ均可調節骨肉瘤的轉移特性，但TAZ對轉移細胞的增殖和遷移的影響更具特異性。

3.4 調控化療耐藥性 化療耐藥性仍是骨肉瘤治療的難點，目前發現YAP/TAZ與化療耐藥性密切相關。Wang等[25]報道YAP過表達時對甲氨蝶呤和阿霉素的耐藥性增加，而敲低YAP的細胞化療敏感性增加。可能的機制是，甲氨蝶呤和阿霉素促進MST1降解和LATS2活化減少，從而抑制YAP磷酸化，促進YAP入核，增加了骨肉瘤細胞系的化療耐藥性[25]。人抗原R(human antigen R，HuR)是一種RNA結合蛋白，可調控多種基因表達。Xu等[26]發現HuR可以直接與YAP結合，增加YAP轉錄活性，增強骨肉瘤細胞的阿霉素敏感性。Luu等[24]在三種犬類骨肉瘤細胞系中也驗證了YAP/TAZ與化療耐藥性相關，并且發現YAP的敲低降低了所有細胞系的阿霉素耐藥性，而TAZ敲低僅降低了一種細胞系的阿霉素耐藥性，提示YAP可能骨肉瘤化療耐藥的關鍵靶點，提示TAZ的作用較為有限。

3.5 維持腫瘤干細胞 腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)是一種特殊的高致瘤細胞亞群，具有自我更新和分化形成腫瘤能力。腫瘤干細胞可能是導致耐藥性、轉移、復發和癌癥死亡的主要原因，而化療和靶向治療無法根除CSC[5]。YAP/TAZ在維持腫瘤干性方面具有重要作用，并且YAP/TAZ失調可導致非惡性干細胞重編程為具有CSC屬性的細胞[27]。在骨肉瘤中，性別決定區Y框蛋白2(SRY-box containing gene 2，Sox2)通過促進YAP激活以維持CSC能力[28]。研究報道Sox2在骨肉瘤組織和細胞中高表達，抑制Sox2表達后，Hippo通路激活，增加YAP的磷酸化，YAP入核減少，細胞干性降低[28]。酪氨酸激酶受體家族AXL蛋白(anexelekto，AXL)在許多惡性腫瘤中高表達，并參與腫瘤發生的多個過程。研究[29]發現YAP/TAZ可促進AXL表達，導致骨肉瘤細胞去分化，增強細胞干性。

4 YAP/TAZ與骨肉瘤治療

如前所述，YAP/TAZ在骨肉瘤中普遍高表達，且活化的YAP/TAZ在腫瘤增殖、轉移、耐藥等方面具有重要意義，因此可能作為骨肉瘤的治療靶點。

臨床的一些小分子抑制劑可直接或間接影響YAP/TAZ活性，且在骨肉瘤中取得了一定效果[30]。達沙替尼是一種重要的靶向Src家族激酶的小分子，被證明可抑制人和犬骨肉瘤細胞系的遷移和侵襲能力[31]。達沙替尼與標準治療方案相結合，可延長骨肉瘤患者的生存時間[32]。帕唑帕尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，已被批準用于治療晚期軟組織肉瘤，在19例難治性骨肉瘤患者中使用帕唑帕尼，68%的患者得到部分緩解或疾病穩定[33]。他汀類藥物主要用于治療脂質代謝疾病，Kany等[34]發現辛伐他汀可以增加人類骨肉瘤的細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。達沙替尼、他汀類藥物和帕唑帕尼等小分子藥物可誘導YAP/TAZ磷酸化，從而抑制YAP/TAZ核表達[30]。但這些藥物仍存在靶點不清楚，作用機制不明確，或全身毒副作用等問題。

維替泊芬在臨床上用于老年性黃斑變性治療。研究[35]發現維替泊芬是目前唯一能夠與YAP和TAZ特異性結合的化合物，通過改變其構象，阻止YAP/TAZ與TEAD結合，抑制下游靶基因轉錄。Morice等[9]報道維替泊芬可以降低骨肉瘤細胞中YAP的表達和YAP/TEAD的轉錄活性，影響骨肉瘤細胞增殖、抗凋亡和侵襲潛能，并抑制小鼠體內原發腫瘤的生長。Zucchini等[8]發現維替泊芬可抑制上游的含RHO關聯卷曲螺旋蛋白激酶2(recombinant RHO associated coiled protein kinase 2，ROCK2)，從而抑制YAP轉錄活性，影響骨肉瘤的進展。上述研究表明，維替泊芬有望成為治療骨肉瘤的新藥物。

部分中藥及植物提取物也能調控Hippo信號通路[36]。Ferraiuolo等[37]發現龍舌蘭提取物通過抑制NF-κB募集到YAP和TAZ啟動子位點，阻止YAP和TAZ轉錄，從而抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和耐藥性。但是，龍舌蘭提取物中抑制YAP/TAZ的具體成分需要進一步明確，并在動物實驗驗證其靶點特異性和抗腫瘤作用。

5 總 結

YAP/TAZ在骨肉瘤的自我更新、增殖、侵襲和轉移中起到重要作用，這表明YAP和TAZ有希望成為骨肉瘤新的治療靶點，對于改善骨肉瘤的臨床治療和預后至關重要[38]。但是，Hippo通路涉及的調控網絡和效應分子非常復雜，目前對于YAP/TAZ在骨肉瘤中的作用仍有待進一步研究。