茜素紅S 對鱸鯉幼魚肌肉抗氧化指標的影響

白天泉，姚俊杰，毛茜，王禮節，羅永泉

（1.貴州大學漁業資源與環境研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生態漁業有限責任公司，貴州 貴陽 550081）

魚類標記技術是評估江、河、湖等水域開展人工增殖放流效果的重要手段之一，通過標記—回捕法可研究魚類的生活史、生長發育以及漁業資源評估等。熒光標記法具有操作簡單、節約成本、標記效果好、適用于大規模放流等特點[1]。在鳙Aristichthys nobilis、斑馬魚Danio rerio、鰱Hypophthalmichthys molitrix、大馬哈魚Oncorhynchus keta、滇池金線鲃Sinocyclocheilus grahami 等魚類標記的應用中效果顯著，浸泡后80～90 d 在普通顯微鏡下檢測到標記色，且在其他不可見光下標記區能長久保持[2-7]。因此在增殖放流和漁業的相關研究中得到越來越多的支持和應用[8]。

在熒光標記的研究中，相對于其他熒光物質標記，茜素紅S（ARS）標記大多應用在魚類的早期發育中，且不同魚類對化學染料的耐受閾值不同，在50～500 mg/L 濃度下標記效果良好[2,5,7,9]。ARS 屬于外源物質，在外源物質的脅迫下可能會造成機體氧化損傷甚至死亡，影響魚類生長發育、存活及生理響應等。目前的研究大多集中在標記效果和持久度[10-12]，而ARS 標記對幼魚抗氧化系統影響的相關報道僅見于中華倒刺鲃Spinibarbus sinens 的研究[13,14]，對鱸鯉幼魚抗氧化指標的影響研究未見報道。

鱸鯉Percocypris pingi 隸屬于鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae，在雅礱江下游野生鱸鯉群體呈現低齡化和小型化發展[15]，被列為瀕危魚類[16,17]。本文通過研究不同濃度ARS 浸泡對鱸鯉幼魚抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶性和丙二醛（MDA）含量的影響，以期掌握熒光染色標記的適宜濃度，并為科學地開展鱸鯉幼魚標記放流提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鱸鯉幼魚采集自貴州省畢節市鑫有農業綜合開發有限責任公司雙坪基地，置于50 cm×60 cm×100 cm 養殖箱中。馴養期間正常投喂飼料；馴養7 d后挑選體質健壯、活動力強、規格均勻的個體用于實驗。實驗所用試劑ARS（C14H7NaO7S）為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），分子量342.26；SOD、CAT、CSH-Px 和MDA 測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

將ARS 配成1 000 mg/L 的母液，用于后續實驗。預實驗和正式實驗在19 cm×13 cm×9 cm 塑料箱中進行。預實驗分為6 個組、正式實驗分為7 個組，每個組設置3 個重復，實驗用水為曝氣24 h 后的自來水。實驗期間，充氧機充分曝氣，正常投喂飼料，早上、下午各投喂一次，每隔1 d 換一次水，每次換水量不超過整個養殖水體的2/3。測得pH（8.3±0.2），水體溫度（14±0.5）℃，溶氧量（8.3±0.1）mg/L，氨氮＜0.2 mg/L。在正式實驗之前，饑餓24 h，隨機取20 尾鱸鯉幼魚測其體長（5.89±0.62）cm、體質量（1.48±0.39）g。

1.2 實驗方法

預實驗以0 mg/L 作為對照組，根據等對數間距系列設置濃度梯度為180 mg/L、240 mg/L、320 mg/L、420 mg/L、560 mg/L、750 mg/L 和1 000 mg/L。每個濃度組投放鱸鯉幼魚20 尾，觀察24 h，確定導致鱸鯉幼魚100%死亡的ARS 最小濃度和不引起死亡的ARS 最大濃度。結果顯示，1 000 mg/L 質量濃度組的鱸鯉幼魚死亡率為100%，0 mg/L、180 mg/L、240 mg/L 質量濃度組的死亡率為0%，320 mg/L、420 mg/L、560 mg/L、750 mg/L 濃度組的死亡率分別為5%、15%、40%、70%，通過直線內插法計算出24 h半致死濃度（LC50）為623.335 mg/L。

在預實驗的基礎上，正式實驗在0 mg/L 對照組和最大耐受濃度組之間按等差數列設置了7 個濃度組，分別為0 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L、240 mg/L，同時浸泡24 h。每個濃度組設置3 個重復，每組投放20 尾鱸鯉幼魚，共投放420 尾，浸泡24 h（0 d 暫養）后取一次，隨后將剩下的鱸鯉幼魚轉入盛有清水的收納箱中暫養，分別在暫養5 d 和10 d 后再取一次樣。取樣時在各濃度組中分別隨機取出3 尾鱸鯉幼魚，使用濃度為200 mg/L 的MS-222 麻醉后，迅速取出鱸鯉幼魚肌肉放入10 mL 離心管中，置于-20℃冰箱保存，用于測定不同濃度ARS 組鱸鯉幼魚肌肉中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量。鱸鯉幼魚都于取樣后投喂人工飼料，整個實驗用時11 d，其余條件與馴養條件一致。

組織勻漿液制備及酶活性測定使用預冷的生理鹽水漂洗鱸鯉幼魚肌肉組織，再用濾紙吸掉肌肉表面的水分，稱取適量的樣品，按照質量∶體積=1∶9 加入4℃預冷的生理鹽水，在冰浴條件下進行勻漿。勻漿液用冷凍離心機在4℃條件下2 000 r/min 下離心10 min，取上清液4℃保存待用。

樣品總蛋白含量、SOD、CAT、GSH-Px、MDA 含量的測定按照試劑盒說明書操作。

1.3 數據分析處理

所測數據采用平均值±標準差（Mean±SD），通過SPSS 26 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 多重比較（0.01＜P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著），采用GraPhPad Prism8 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 鱸鯉幼魚肌肉SOD 酶活性變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉SOD 活性變化見圖1。由圖1 可知：ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h（暫養0 d），40 mg/L 濃度組肌肉SOD 活性（38.21±1.62）U 開始被誘導，但是，與對照組（36.66±1.65）U 差異不顯著（P＞0.05），從80 mg/L 濃度組（40.55±1.15）U 開始，SOD 活性顯著升高（P＜0.05），120～200 mg/L濃度組極顯著升高至（43.44±1.12）U、（42.25±1.43）U、（46.22±1.91）U（P＜0.01），200 mg/L濃度組的SOD 活性達到最大，而當ARS 濃度到達240 mg/L（32.87±0.94）U 時受到抑制，SOD 活性急速下降，顯著低于對照組水平（P＜0.05）；在ARS 浸泡后第5 d，40 mg/L、160 mg/L 與對照組（35.57±1.24）U 差異不顯著（P＞0.05），除了在80 mg/L 濃度組被顯著誘導上升（38.98±1.61）U（P＜0.05）外，160～240 mg/L 濃度組被顯著抑制（P＜0.05）。浸泡標記后第10 d，除了160 mg/L（37.97±1.11）U 和200 mg/L（33.16±0.68）U 濃度組，分別被顯著誘導和抑制外（P＜0.05），其他濃度組已恢復至對照組（35.82±1.02）水平（P＞0.05）。

圖1 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉SOD 活性變化Fig.1 Changes in SOD activity in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

2.2 鱸鯉幼魚肌肉CAT 酶活性變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉中CAT活性變化見圖2。由圖2 可知：ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h 后（0 d）肌肉CAT 活性與SOD 活性變化一致，隨濃度梯度升高呈先上升后下降，在160～200 mg/L ARS 處理后CAT 活性相比對照組（14.52±0.62）U呈極顯著上升（P＜0.01），其他濃度組與對照組無顯著差異（P＞0.05）；ARS 浸泡后第5 d，40 mg/L 濃度組CAT 活性顯著低于對照組（14.37±1.75）U（P＜0.05），隨之逐漸上升，到120 mg/L 濃度組（21.81±0.81）U 時達到最大值（P＜0.01），160～240 mg/L 濃度組時急劇下降，顯著低于對照組（P＜0.05）；暫養10 d后，低濃度組基本恢復到正常水平，與對照組（15.33±1.90）U 差異不顯著（P＞0.05），而高濃度組中CAT 活性在160 mg/L（20.03±1.18）U 顯著升高（P＜0.05），隨著ARS 濃度的不斷加大，到200 mg/L（9.35±0.96）U（P＜0.01）和240 mg/L（10.42±1.04）U（P＜0.05）濃度組CAT 酶活性被抑制，顯著低于對照水平。

圖2 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉CAT 活性變化Fig.2 Changes in CAT activity in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

2.3 鱸鯉幼魚肌肉GSH-Px 酶活性變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉中GSH-Px 活性變化見圖3。由圖3 可知：各濃度組ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h（暫養0 d）后，肌肉中GSH-Px 活性呈波浪式變化，整體呈現誘導作用，GSH-Px 活性高于對照組（42.23±1.47）U，40 mg/L、120 mg/L、200 mg/L 濃度組（P＜0.01）極顯著上升，80 mg/L、160 mg/L、240 mg/L濃度組顯著升高（P＜0.05）；暫養5 d 后，80 mg/L 濃度組顯著升高于對照組（39.21±1.28）U（P＜0.05），160～240 mg/L 濃度組極顯著低于對照水平；經過10 d 的暫養后，40～120 mg/L 濃度組恢復到對照組水平（35.28±0.89）U（P＞0.05），160～240 mg/L 濃度組GSH-Px 活性持續被消耗，極顯著低于對照水平（P＜0.01），表現抑制作用。

圖3 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉GSH-Px 活性變化Fig.3 Changes in GSH-Px activity in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

2.4 鱸鯉幼魚肌肉MDA 含量變化

不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚MDA 含量變化見圖4。由圖4 可知：浸泡24 h（0 d）后，鱸鯉幼魚肌肉MDA 含量呈先降低后上升的趨勢，40～120 mg/L 濃度組顯著低于對照組（1.36±0.13）nmol/mg（P＜0.05），之后持續升高，從160～240 mg/L 濃度組顯著高于對照組（P＜0.05）。值得注意的是，當ARS濃度加到200 mg/L 后MDA 活性達最大值[（2.02±0.12）nmol/mg]（P＜0.01）；ARS 浸泡后第5 d，120～240 mg/L 濃度組MDA 含量急劇下降，顯著低于對照組[（0.79±0.11）nmol/mg]（P＜0.05），而40 mg/L 和80 mg/L 濃度組已恢復到正常水平（P＞0.05）；ARS 浸泡后的第10 d，除了160 mg/L 濃度組和200 mg/L 濃度組顯著高于對照組之外（0.64±0.10）nmol/mg（P＜0.05），其余濃度組MDA 含量雖然有波動，但是均與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 不同濃度ARS 溶液浸泡鱸鯉幼魚肌肉MDA 含量變化Fig.4 Changes in MDA content in the muscles of Percocypris pingi juveniles soaked in ARS solution at different concentrations

3 討論

3.1 茜素紅S 對鱸鯉幼魚肌肉抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是魚體內重要的抗氧化指標[18,19]，三者共同協作，聯合清除魚體內的氧自由基（ROS）[20]，降低氧化應激損傷。一般認為，SOD是抵御氧自由基的第一道防線，最先與氧自由基作用。它的主要功能是清除魚體內的超氧陰離子（O2-·），分解成分子氧和過氧化氫（H2O2），H2O2在CAT 和GSH-Px 的作用下分解成H2O 和O2，因此這些酶能夠清除氧自由基，保護細胞不受氧自由基損傷[21,22]。

ARS 浸泡鱸鯉幼魚24 h（ARS 浸泡后0 d），引起機體應激反應，產生過量ROS，鱸鯉的代謝隨濃度的增加逐步加強，本研究中SOD 和CAT 酶活性變化具有相關性，都表現出拋物線型劑量效應，即低濃度促進高濃度抑制。在低濃度組時，SOD 升高，分解過多的O2-·產生大量的H2O2，刺激CAT 活性也相應的升高，加速分解H2O2，此時SOD、CAT 活性被誘導升高，但是在200 mg/L 濃度組時，超過它們的調節閾值，體內大量的氧自由基積累，發生氧化損傷，隨后SOD 和CAT 活性開始下降，CAT 活性顯著低于對照組，表明此時鱸鯉肌肉受到了毒性影響，大量的自由基抑制了SOD 和CAT 的合成或被消耗。這與尖紫蛤Sanguinolaria acuta、斑馬魚、中華倒刺鲃的研究一致[14,23,24]，且都出現了“劑量效應”，ARS 浸泡后第5 d，低濃度組SOD、CAT 和GSH-Px活性開始恢復，第10 d 時低濃度組恢復到正常水平，但是160～240 mg/L 濃度組酶活性依舊低于對照水平，說明SOD 與CAT 持續被消耗，體內仍舊存在ROS，經過10 d 暫養也沒能恢復到正常水平。

GSH-Px 和CAT 是分解H2O2的重要酶。GSH-Px 可被H2O2氧化生成H2O，將還原性谷胱甘肽（GSH）變成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。值得注意的是，在遇到外源物質刺激脅迫時鱸鯉幼魚GSH-Px首先響應，這與郭鶴等[3]的研究不同，不同魚類的不同器官中抗氧化酶活性調節閾值不同，其原因可能是鱸鯉肌肉中GSH-Px 與CAT 和SOD 的響應模式不同，整個過程處于動態平衡的狀態。這也可能是與CAT 存在競爭，肌肉中不同抗氧化酶作用的階段不同，此過程需要進一步研究。

3.2 茜素紅S 對鱸鯉幼魚肌肉MDA 的影響

MDA 是活性氧自由基攻擊生物膜發生脂質過氧化的產物[25]，也可以與蛋白質的游離氨基酸作用，引起蛋白質分子內和分子間交聯，導致細胞損傷[26]。MDA 的含量可以用來衡量氧化損傷的程度[27]。

霍來江[13]使用ARS 浸泡中華倒刺鲃24 h 后，腦中MDA 含量隨濃度梯度先減少后上升。潘建雄使用茜素絡合物浸泡鳙48 h 后第15 d，肌肉中MDA 含量隨濃度梯度先降低后升高，且都低于對照組[6]，在段必成[4]的研究中也有類似“低抑高促”的現象，這與本研究結果一致。ARS 浸泡24 h 后，鱸鯉肌肉中MDA 含量呈先下降低于對照水平后逐漸上升。在小于200 mg/L 濃度組中雖然MDA 含量在不斷升高，損傷程度也在不斷加深，但是，SOD、CAT、GSH-Px 的活力總體也同時呈上升趨勢，說明抗氧化酶活性足夠彌補ARS 脅迫下產生的氧化損傷。這與鎘對尖紫蛤抗氧化酶活性及脂質過氧化的研究結果一致[23]。與低鹽度脅迫對鯔Mugil cephalus 幼魚肌肉MDA 含量的研究也一致[28]。在200 mg/L 濃度組達到最大值，說明鱸鯉肌肉抗氧化調節系統達到閾值，已造成毒害作用。

小于120 mg/L 組ARS 浸泡后5～10 d，MDA 基本恢復，但是，在第5 d 160～240 mg/L 濃度組MDA含量仍顯著低于對照水平，同時SOD、CAT 和GSH-Px 活性也被抑制低于對照組，說明高濃度組中產生的抗氧化酶持續被消耗，在不斷地修復機體所受到的氧化損傷。到第10d 時，160mg/L和240mg/L濃度組MDA 含量高于對照組，同時，SOD、CAT、GSH-Px 活性受到不同程度的抑制并且低于對照水平，是因為高濃度ARS 脅迫下，鱸鯉幼魚肌肉產生的氧自由基超過了抗氧化系統的調節的范圍，顯著抑制了CAT 和GSH-Px 等抗氧化酶活性，說明暫養10 d 后高濃度組ARS 對鱸鯉肌肉造成不可逆的損傷。

3.3 茜素紅S 浸泡鱸鯉幼魚的合理濃度

本實驗結果表明，浸泡后第10 d，40～120 mg/L濃度組SOD、CAT、GSH-Px 酶活力基本能恢復到正常水平，160 mg/L 濃度組時CAT、GSH-Px 活力和MDA 含量出現轉折，前者開始下降，后者上升。根據抗氧化酶耐受最低閾值原則以及丙二醛含量變化情況，40～160 mg/L 間的ARS 對鱸鯉幼魚抗氧化指標的影響較小。結合趙亞鵬等[7]的研究，使用ARS對滇池金線鲃浸泡24 h 時150 mg/L 的ARS 溶液熒光標記效果良好。因此，4.27～6.51 cm 規格的鱸鯉幼魚推薦使用100～150 mg/L濃度的ARS進行標記。