殼聚糖-卡那霉素接枝物的制備及抑菌性能研究

何俊鵬 歐陽茜茜 王藝瑾 盛軍 田洋 高斌

殼聚糖-卡那霉素接枝物的制備及抑菌性能研究

何俊鵬1,2,3歐陽茜茜4,5王藝瑾1,2,3盛軍2,3田洋1,2,3高斌1

（1. 云南農業大學食品科學技術學院 云南昆明 650201；2. 食藥同源資源開發與利用教育部工程研究中心 云南昆明 650201；3. 云南省生物大數據重點實驗室 云南昆明 650201；4. 廣東醫科大學海洋醫藥研究院 廣東湛江 524023；5. 廣東湛江海洋醫藥研究院 廣東湛江 524023）

殼聚糖被廣泛應用于食品中，但其抑菌性能較弱。為了提高殼聚糖的抑菌性能，接枝卡那霉素，制備殼聚糖-卡那霉素接枝物，將其作為一種理想的抑菌材料應用到食品中。以殼聚糖和卡那霉素為主要原料，通過單因素試驗研究反應溫度、反應時間及高碘酸鈉用量對殼聚糖氧化醛基含量的影響，結合響應面試驗優化確定殼聚糖氧化的最佳條件；將氧化的殼聚糖粉末溶液與卡那霉素溶液混合，在60℃的油浴鍋中反應6 h，得到殼聚糖-卡那霉素接枝物溶液；經透析冷凍干燥得到接枝物，將殼聚糖和接枝物進行抑菌性能比較。結果表明：殼聚糖氧化的最佳條件為反應時間4 h、高碘酸鈉用量4.8 g、反應溫度40℃，在此條件下計算出醛基含量為4.89 mmol/g，理論值（4.07 mmol/g）與試驗值的相對偏差為0.82%；將氧化的殼聚糖與卡那霉素進行席夫堿反應，顯示卡那霉素成功接枝上，元素分析計算得知，接枝物中卡那霉素的接枝率達到52%；通過抑菌試驗可知，接枝物的抑菌性能優于殼聚糖。

殼聚糖；卡那霉素；響應面法；結構表征；抑菌性能

殼聚糖（Chitosan，CS）具有優異的降解性、相容性及一定的抑菌性，在許多領域（食品、醫藥）被應用[1-3]，也常作為保鮮劑用于食品中；但是由于其溶解性較差，只能在酸性介質中溶解，限制了其抑菌性能和在食品中的應用?？敲顾鼐哂泻軓姷囊志阅埽虼丝赏ㄟ^接枝卡那霉素來改性殼聚糖，并且殼聚糖基抗菌材料是當前的研究熱點，具有良好的抑菌性能[4-6]；研究者采用化學改性的方法來改善殼聚糖的溶解性和抑菌性能，使其具有更廣泛的應用前景[7-8]。目前對殼聚糖改性的方法有在殼聚糖的羥基部分引入烷基，生成衍生物[9]。殼聚糖衍生物有3種合成方法：N-鄰苯二甲?；╗10]、生成席夫堿法[11]、金屬模板合成法等[12]，也可以利用等離子體對材料進行改性，改變其抗菌性[13-14]。殼聚糖衍生物被認為是增加殼聚糖抑菌性能的最佳選擇之一，因為醛或酮的羰基可以與殼聚糖的-NH2基團有效偶合，形成具有亞胺基團特征的殼聚糖席夫堿[15]。殼聚糖席夫堿衍生物改變了殼聚糖的分子結構，增強了其親水性并增加了帶正電荷的離子數量，與未改性殼聚糖相比，殼聚糖席夫堿衍生物的抑菌活性更優異[16-17]。

卡那霉素（Kanamycin，KANA），屬于氨基糖苷類抗生素[18]。氨基糖苷類（aminoglycosides，AGs）藥物主要用于抑制革蘭氏陰性細菌，使細菌不能生長[19-20]，但是這類藥物具有較強的毒性[21-22]。抗生素藥物會進入人體的毛細胞，誘導其產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[23]，從而導致毛細胞發生氧化損傷，促進其凋亡[24]，并且抗生素的不合理使用會導致耐藥細菌的產生。

目前經殼聚糖化學改性形成的衍生物有很多，但殼聚糖接枝卡那霉素形成的接枝物目前尚未見報道。本研究旨在通過接枝卡那霉素對殼聚糖進行改性，形成大分子化合物，一方面可以增強殼聚糖的抑菌性能和溶解性，另一方面降低卡那霉素的副作用，并把制備好的接枝物（殼聚糖-卡那霉素接枝物，CS-KANA）作為保鮮劑應用到食品中，為進一步研究其抑菌性能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 大腸桿菌（CMCC 10389，中國工業微生物菌種保藏管理中心）；金黃色葡萄球菌（ATCC 10384，中國工業微生物菌種保藏管理中心）；殼聚糖（分子量：544 kDa，脫乙酰度：90%）、硫酸卡那霉素、鹽酸羥胺（分析純，索萊寶生物科技有限公司）；冰乙酸、甲醇（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；高碘酸鈉、乙二醇（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；百里酚藍（分析純，天津市光復科技發展有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；1 μm尼龍濾膜（海寧市聯眾過濾設備有限公司）；透析袋（8 000 Da，上海葉源生物有限公司）。

1.1.2 儀器與設備 YP-5001電子分析天平（上海光正醫療儀器有限公司）；pHS-3C雷磁pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；HH-11-2恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；HH-W3S旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SHZ-D（111）循環水式多用真空泵（上海亞榮生化儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 氧化殼聚糖（OCS）單因素實驗設計

1.2.1.1 不同反應時間的影響 將3 g的殼聚糖粉末溶于200 mL 1%乙酸溶液中，在40℃的條件下攪拌3 h；加入質量為4.8 g、濃度為0.22 moL/L的高碘酸鈉溶液100 mL，并把混合的溶液放在水浴鍋中，在一定溫度和避光條件下分別反應2、3、4、5、6、7 h；加入乙二醇溶液（20 mL，0.1 mol/L）終止反應1 h，透析2 d，將透析好的溶液在50℃下用蒸發濃縮儀進行濃縮和冷凍干燥。

1.2.1.2 不同反應溫度的影響 稱取殼聚糖的質量和溶解方式與1.2.1.1相同，加入質量為4.8 g、濃度為0.22 moL/L的高碘酸鈉溶液100 mL，并把混合的溶液放在水浴鍋中，避光條件下分別在20、30、40、60、70℃下反應一段時間；加入乙二醇溶液（20 mL，0.1 mol/L）終止反應1 h，透析2 d，將透析好的溶液在50℃下用蒸發濃縮儀進行濃縮和冷凍干燥。

1.2.1.3 不同用量高碘酸鈉溶液的影響 稱取殼聚糖的質量和溶解方式和1.2.1.1相同，分別加入殼聚糖與高碘酸鈉質量比為5∶1、5∶2、5∶4、5∶6、5∶8、5∶10的高碘酸鈉溶液100 mL，在一定溫度和避光條件下反應一段時間；加入乙二醇溶液（20 mL，0.1 mol/L）終止反應1 h，透析2 d，將透析好的溶液在50℃下用蒸發濃縮儀進行濃縮和冷凍干燥。

1.2.2 氧化殼聚糖醛基含量和氧化度計算 參考潘志文等[1]并稍作修改。在錐形瓶中加入質量濃度為20 g/L的鹽酸羥胺-甲醇溶液50 mL，向錐形瓶內滴加百里酚藍指示劑，此時溶液呈現出紫色；用0.03 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，滴加至溶液呈黃色，此時不計氫氧化鈉-甲醇溶液的體積；向錐形瓶中加入0.1 g制備的CS-KANA，振蕩錐形瓶使溶液充分混合，若樣品中含有醛基，溶液會立即變成粉紅色；使用0.03 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液繼續滴定使溶液變成黃色，并且不變色30 s，如果變色應該繼續滴定到不變色，然后記錄氫氧化鈉-甲醇溶液最終的滴定體積。醛基含量的計算公式如下：

式中：（CHO）為樣品中醛基的含量，單位mmol/g；0.03表示氫氧化鈉-甲醇溶液的濃度，單位mol/L；為滴定結束后使用的氫氧化鈉-甲醇的體積，單位L；為加入樣品的質量，單位為g。

利用得到的醛基含量值，可以計算得到樣品的氧化度（OD），單位為%。計算公式如下：

式中：為樣品的氧化度；（CHO）為樣品中醛基的含量，單位mmol/g；1/2指一個氧化后的殼聚糖單體分子含有2 mol的醛基；為加入樣品的質量，單位為g。

1.2.3 響應面實驗方法 在單因素實驗基礎上，參考Box-Behnke實驗設計原理，以醛基含量為響應值，利用設計專家軟件，以反應時間、反應溫度以及高碘酸鈉用量為主要考察因子，如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設計

1.2.4 殼聚糖-卡那霉素接枝物的制備 殼聚糖-卡那霉素接枝物的制備：用1%醋酸溶液溶解氧化殼聚糖，用1 μm的濾膜過濾，調節濾液pH為6.0；加入卡那霉素溶液（氧化殼聚糖與硫酸卡那霉素的質量比為1∶1），加熱到60℃，攪拌6 h，使氧化殼聚糖上的醛基與卡那霉素上的氨基發生席夫堿反應生成碳氮雙鍵；用蒸餾水透析3 d，然后收集溶液進行冷凍干燥，即得到接枝物。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析 分別將殼聚糖、卡那霉素、氧化殼聚糖和殼聚糖-卡那霉素樣品與溴化鉀（KBr）干粉混合[（樣品）∶（KBr）=1∶100]；混合均勻后研磨，用壓片器壓成透明薄片狀，然后測定樣品的紅外光譜（FT-IR）。

1.2.6 接枝率分析 采用Flash EA 1112型號元素分析儀分別對殼聚糖、氧化殼聚糖和殼聚糖-卡那霉素接枝物進行C、N元素的含量測定。測試方法為杜馬斯燃燒法，使得測試樣品的N轉化成N2，所有形式的C都轉化為CO2，最后CO2和N2通過色譜柱分離；分別用熱導檢測器檢測，得出C、N含量，從而計算接枝率，標準品為天門冬氨酸和尿素。接枝率計算公式如下：

式中：為氧化殼聚糖中的N含量；為卡那霉素接枝率；為硫酸卡那霉素中N含量；為殼聚糖-卡那霉素中的N含量。

1.2.7 接枝物最低抑菌濃度（MIC）的測定 接枝物對金黃色葡萄球菌（）、大腸桿菌（）的抑菌率，是通過計算營養瓊脂稀釋法培養的細菌生長菌落數來測定[25]。首先，在細菌培養液（107CFU/mL）中加入配好的接枝物母液（稱取一定質量的接枝物，然后用1%乙酸溶解，配成的母液濃度為10 mg/mL），使各試管的濃度分別為0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0 mg/mL（0為正常組，菌液濃度為107CFU/mL，不加任何試劑），在37℃下振蕩培養24 h；取出100 μL細菌培養物并用無菌生理鹽水連續稀釋至預定濃度；將100 μL稀釋的溶液滴加在營養瓊脂平板上，輕輕地用無菌涂布棒在平板上均勻地涂布；隨后置于37℃培養箱中培養24 h，獲得活微生物菌落并計數（抑菌率達到90%為接枝物的MIC）。

1.2.8 抑菌率的測定 通過1.2.6的方法得到接枝物的MIC，重復1.2.7中的步驟計算殼聚糖和接枝物在同等濃度下的抑菌率。

1.2.9數據處理 每一個實驗結果的測定都重復3次，結果取3次平均值，采用Excel 2013、SPSS 24、Graphpad Prism5對實驗數據進行整理及統計分析，利用Design-Expert 8.0.6進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1反應時間對氧化殼聚糖醛基含量和氧化度的影響 由圖1可知，反應前期，當反應時間為2～4 h時，醛基含量與氧化度都呈現逐漸遞增的趨勢，且醛基含量都在4 mmol/g以上，氧化度在30%～40%；反應后期，當反應時間為5 ～7 h時，醛基含量、氧化度都呈現遞減趨勢，醛基含量在4 mmol/g以下，氧化度在30%以下。因為隨著反應時間的增加，醛基會被氧化成羧基，導致醛基含量下降。綜上所述，最佳的反應時間為4 h。

圖1 反應時間對醛基含量和氧化度的影響（n=3）

2.1.2 反應溫度對醛基含量和氧化度的影響 由圖2可知，當反應溫度為20～40℃時，醛基含量與氧化度呈現逐漸增加的趨勢，并在40℃為最高值，醛基含量達到5.5 mmol/g，氧化度接近40%；當反應溫度為50～70℃時，醛基含量與氧化度逐漸減少，在70℃為最低值；因為隨著溫度的升高，高碘酸鈉會發生熱分解，導致醛基含量下降。綜上所述，最佳的反應溫度為40℃。

圖2 反應溫度對醛基含量和氧化度的影響（n=3）

2.1.3 高碘酸鈉用量對醛基含量和氧化度的影響 由圖3可知，增加高碘酸鈉的用量，醛基含量和氧化度也會隨之增加，并且隨著高碘酸鈉用量的增加，溶液的顏色從淡黃色變為紫紅色；當高碘酸鈉用量為4.8 g時，醛基含量和氧化度接近最高點，分別接近4 mmol/g、30%，隨著高碘酸鈉用量的增加，醛基含量和氧化度基本不變。綜上所述，最佳高碘酸鈉用量為4.8 g。

圖3 高碘酸鈉用量對醛基含量和氧化度的影響（n=3）

2.2 響應面實驗設計結果

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 根據單因素實驗結果，進行響應面優化試驗設計，實驗結果見表2、3。

以反應時間、反應溫度以及高碘酸鈉用量為主要考察因子，同時以醛基含量為響應值，對表3的數據進行分析處理，通過二次方程式擬合（非線性），得到醛基含量（值）的目標函數的二次回歸方程。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

表3 響應面實驗回歸模型方差分析

注：**表示差異極顯著（<0.01）*表示差異顯著（<0.05）。

=4.66–0.035–8.750E–0.03–0.036–0.09–0.025–0.452–0.432–0.342

由表3可知，模型值為0.000 2，說明該模型極顯著。失擬項值為0.936 2，大于0.05，不顯著，說明該回歸模型與實際試驗有較好擬合性，自變量與醛基含量之間關系顯著。相關系數2為0.925 6，2為0.967 5，說明響應面法設計所得的回歸模型有效，預測效果較佳，可用該模型對殼聚糖的醛基含量及氧化度進行分析和預測。2、2及2的值均小于0.01，表明影響極顯著。3個單因素影響殼聚糖的醛基含量、氧化度的順序均為高碘酸鈉用量>反應時間>反應溫度，即高碘酸鈉的用量對殼聚糖的醛基含量以及氧化度的影響最顯著。

2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗證 經Box-Behnken實驗設計，利用設計專家軟件對試驗數據進行分析處理后，得到氧化殼聚糖的最優條件為高碘酸鈉用量4.8 g，溫度40℃，時間4 h；在此條件下，獲得氧化殼聚糖的醛基含量為4.89 mmol/g，理論值4.07 mmol/g與試驗值的相對偏差為0.82%，驗證了此模型的準確性和有效性。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

殼聚糖的紅外光譜分析結果（圖4）顯示：3 380 cm–1處為-OH的伸縮振動重疊后的多重吸收峰，2 924和2 878 cm–1處為C-H的伸縮振動吸收峰[25-26]，1 656 cm–1處為殼聚糖（C-O）的伸縮振動峰，1 596 cm–1處為殼聚糖的（N-H）的面內彎曲振動，1 380 cm–1處左右出現了吸收峰，這是由CH3的對稱變形振動引起的[27]。殼聚糖被氧化后，1 656和1 596 cm–1處的峰會合并成一個峰，被氧化后會在1 721 cm–1處出現一個新的峰[28]，且由于卡那霉素接枝殼聚糖后形成碳氮雙鍵，在1 657 cm–1波長處出現峰[29]。結果表明，卡那霉素成功接枝到殼聚糖上。

圖4 CS，OCS，KANA和CS-KANA的紅外光譜圖

2.4 接枝率分析

由表4可知，CS、OCS、CS-KANA的C含量依次減少，從39.38%逐漸減少為37.74%，N含量也呈減少趨勢。氧化殼聚糖的C/N高于殼聚糖的C/N，原因是其在氧化過程中產生具有揮發性的NH3[30]。將卡那霉素接枝到氧化殼聚糖上提高了N含量，降低C/N，因為一分子卡那霉素有5個氨基。根據N的變化，計算出殼聚糖-卡那霉素接枝物中卡那霉素的接枝率約為52%。

表4 CS、OCS和CS-KANA的元素分析

2.5 接枝物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）測定

由圖5-A、5-D可知，當接枝物濃度為0.16 mg/mL時，通過涂板計算得到金黃色葡萄球菌（）的抑菌率大于90%。由圖5-B、5-C可知，當接枝物濃度為0.32 mg/mL時，涂板計算得到大腸桿菌（）的抑菌率大于90%。因此接枝物對大腸桿菌（）和金黃色葡萄球菌（）的MIC分別為0.32、0.16 mg/mL。

A. S.aureus; B. E.coli; C. E.coli; D. S.aureus。

2.6 抑菌率測定

由圖6-A、6-B可知，在最低抑菌濃度下通過涂板分析CS和接枝物對大腸桿菌（）和金黃色葡萄球菌（）的抑菌率。由圖6-C可知，在同等濃度（0.16 mg/mL）下，接枝物對金黃色葡萄球菌（）的抑菌率大于CS，并且具有顯著性差異。由圖6-D可知，在同等濃度（0.32 mg/mL）下，接枝物對大腸桿菌（）的抑菌率大于CS，并且具有顯著性差異。因此，接枝物的抑菌性能優于CS。

A. S.aureus; B. E.coli; C. S.aureus; D. E.coli。

3 結論

本實驗通過單因素和響應面優化得到最優的氧化殼聚糖參數為高碘酸鈉用量4.8 g，溫度40℃，時間4 h。在此條件下，醛基含量為4.89 mmol/g，通過席夫堿反應將卡那霉素接枝到氧化殼聚糖上。傅里葉變換紅外光譜分析結果表明，卡那霉素成功接枝到殼聚糖上，元素分析結果表明，卡那霉素的接枝率為52%。在接枝物的最低抑菌濃度下涂板分析接枝物的抑菌率大于CS，說明接枝物的抑菌性能優于CS。

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Preparation Process and Antibacterial Performance of Chitosan-kanamycin Graft

HE Junpeng1,2,3OUYANG Qianqian4,5WANG YiJin1,2,3SHENG Jun2,3TIAN Yang1,2,3GAO Bin1

(1. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China; 2. Development and Utilization of Food and Drug Homologous Resources Engineering Research Center of the Ministry of Education, Kunming, Yunnan 650201, China; 3. Yunnan Key Laboratory for Biological Big Data, Kunming, Yunnan 650201, China; 4. Marine Biomedical Research Institute, Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong 524023, China; 5. Guangdong Zhanjiang Institute of Marine Medicine, Zhanjiang, Guangdong 524023, China)

Chitosan is widely used in foods, but its antibacterial properties is weak. In order to improve the antibacterial properties of chitosan, kanamycin was grafted to prepare chitosan-kanamycin grafts to make it possible as an ideal antibacterial material applied to food. In this study, chitosan and kanamycin were used as the main raw materials, and the effects of reaction temperature, reaction time and sodium periodate dosage on the content of chitosan oxidized aldehyde groups were studied by single factor experiments. The best conditions for sugar oxidation was determined by response surface methodology ,then, the oxidized chitosan powder solution was mixed with the kanamycin solution and reacted in an oil bath at 60℃ for 6 h. The solution was dialyzed for two days and then freeze-dried to obtain a graft. The comparison on antibacterial performance of Chitosan and craft was carried out.The optimal conditions for chitosan to be oxidized were the reaction time, sodium periodate dosage and reaction temperature of 4 h, 4.8 g, and 40℃. Under these conditions, the aldehyde group content was calculated to be 4.89 mmol·g–1, and the relative deviation between the theoretical value of 4.07 mmol·g–1and the experimental value was 0.82%. The oxidized chitosan and kanamycin were subjected to Schiff base reaction, and the results were analyzed. It showed that kanamycin was successfully grafted. Elemental analysis calculated that the grafting rate of kanamycin in the graft was 52%. According to the antibacterial rate, the antibacterial performance of the graft was better than that of chitosan.

Chitosan; kanamycin; response surface methodology; structure characterization; antibacterial performance

TS201.21

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.10.010

2022-02-11；

2022-03-14

云南省科技廳重大專項-重要藥食兼用資源生物制造技術開發及應用（No.2018ZI001，No.202002AA100005）；云南省重大科技專項-綠色食品國際合作研究中心項目（No.2019ZG00905）；云南省中青年學術和技術帶頭人后備人才（No.2018HB040）；辣木崗位科學家項目（No.CARS-11-YNSJ）。

何俊鵬（1996—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學，E-mail：2311069588@qq.com。

高斌（1972—），博士，副教授，研究方向為食品營養與安全，E-mail：doc_gao@sina.com。

(責任編輯 林海妹)