牛隱孢子蟲檢測技術研究進展

張國帥 韓金城 許應天

（延邊大學農學院，吉林 延吉 1 330002）

0 引言

隱孢子蟲呈世界性流行和分布，是引起哺乳動物腹瀉的重要致病原蟲［1］。目前，已鑒定的隱孢子蟲有30多種［2］。我國隱孢子蟲傳播范圍較廣，糞—口途徑傳播是其主要的傳播方式。據報道，我國繼1986年陳義民等［3］在甘肅省蘭州市犢牛中首次發現隱孢子蟲后，王妍等［4］在陜西省、吉林省、上海市等地也相繼發現了隱孢子蟲。

隱孢子蟲在牛群中的感染情況相當普遍，其基因亞型較多，包括芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲等。斷奶后，犢牛對隱孢子蟲尤為敏感。我國犢牛主要感染的隱孢子蟲亞型為牛隱孢子蟲和微小隱孢子蟲［5］。隱孢子蟲嚴重危害養牛業，是造成犢牛死亡的主要原因之一，并且目前沒有有效的針對隱孢子蟲病的治療方法，更多的是要及時進行防控，切斷傳染源。因此，對隱孢子蟲及其基因型檢測技術進行研究具有重要意義。

1 病原形態學檢測

目前，病原形態學觀察依然是最常用的隱孢子蟲檢測方法。Henriksen等［6］于1981年采用改良抗酸染色法檢測隱孢子蟲卵囊，在顯微鏡下可明顯區分粉紅色的隱孢子蟲與其他顆粒物及雜質。該方法是牛隱孢子蟲檢測方法中應用最為廣泛的一種，具有簡單、快捷、成本低、對儀器要求不高等特點，但是敏感性較低，并且無法鑒定亞型和基因型，僅適用于初步鑒定。

2 免疫學檢測

現階段常見的免疫學檢測隱孢子蟲的方法有酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）等。該試驗不需要濃縮糞便樣品就能夠快速檢測大批量糞便樣品，卵囊檢測限為103～104個/mL。免疫學檢測與病原形態學檢測相比有著更高的敏感度和準確性，并且消除了病原形態學檢測存在的主觀性。但免疫學檢測也無法確定隱孢子蟲的基因亞型，只能用于初步檢測。

3 分子生物學檢測

目前，應用于牛隱孢子蟲及其蟲種鑒定研究的分子生物學技術有聚合酶鏈式反應、環介導等溫擴增、基因芯片、DNA測序技術等［7］。

3.1 聚合酶鏈式反應

1991年，Laxer等［8］首次將聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）應用于隱孢子蟲的鑒定。自采用常規PCR技術鑒定隱孢子蟲以來，延伸出了采用巢氏PCR、定量PCR、PCR-RFLP等檢測隱孢子蟲的技術。現階段，小亞基核糖體rRNA（18S rRNA）、卵囊壁蛋白（COWP）、熱休克蛋白（HSP70）、肌動蛋白（G-actin）等編碼基因常作為分子標記的基因位點。其中，隱孢子蟲18S rRNA基因保守性高，容易設計PCR引物。因此，大多數學者采用18S rRNA作為基因位點，能夠鑒別幾乎所有的隱孢子蟲亞型。

3.1.1 常規PCR。Laxer等［8］首次使用PCR技術檢測隱孢子蟲。宰德富等［9］從牛和人糞便中的微小隱孢子蟲提取出DNA，然后克隆出一個2.3 kb的微小隱孢子蟲DNA片段，選擇其中一條452 bp片段為靶序列，并且設計了一對含有26個堿基的引物和兩個含有20個堿基的探針［9］，證實了該引物為特征性片段。馬良等［10］利用聚合酶鏈反應（PCR）原理建立一種敏感且特異的方法（常規PCR）檢測人和動物糞便標本中的微小隱孢子蟲，證明常規PCR方法的敏感性明顯高于傳統病原分離鑒定和血清學鑒定。常規PCR鑒定具有成本低、敏感性高、適合大數量檢測的優點，但擴增產物需要純化測序，浪費時間，且易出現假陽性或假陰性的結果。

3.1.2 巢式PCR。巢式PCR是鑒定牛隱孢子蟲亞型最常用的聚合酶鏈式反應技術之一。Balatbat等［11］在1996年首次使用巢式PCR（Nested-PCR）檢測隱孢子蟲，用兩段引物成功擴增出一條400 bp的特異性片段，在抗酸染色法檢測為陰性的28例樣本中檢測出4例陽性樣本，發現巢式PCR技術比病原形態學觀察敏感性更高、特異性更強、穩定性也更好。王權等［12］應用巢式PCR對牛糞便中的隱孢子蟲進行檢測，每克糞便最少檢測出5個卵囊，其敏感性比常規PCR高100倍。嚴若峰等［13］使用巢式PCR、普通PCR及病原形態學觀察對比檢測隱孢子蟲，119份樣品中有5例普通PCR檢測為陰性，而巢式PCR檢測為陽性，在隱孢子蟲卵囊含量較低的樣本中普通PCR很難檢出，而巢式PCR較普通PCR更為敏感，提高了低含量樣本中成功檢測的可能性。張龍現等［14］完善了巢式PCR檢測體系，成功擴增出820 bp特異性反應條帶，卵囊最低檢測值≤2.86個/mL，敏感性大大提高。雖然巢式PCR的敏感性很高，但極易被污染，尤其是應用于牛隱孢子蟲的檢測時。這是因為糞便雜質較多，會導致DNA擴增受到限制。因此，檢測人員應該嚴格把控DNA的提取，防止樣本雜質過多影響試驗結果。

3.1.3 定量PCR。Homen等［15］建立了用于檢測牛微小隱孢子蟲的定量（Real-time）PCR方法，以肌動蛋白為基因位點對209份樣品進行檢測，并與巢式PCR進行對比，發現Real-time PCR比巢式PCR檢測率高16.7%，但此方法只能用于檢測微小隱孢子蟲，其他亞型無法特異性擴增。Burnet等［16］針對牛感染隱孢子蟲亞型建立了新型Real-time PCR，基于18S rRNA基因位點設計通用型的TaqMan測定法，可以特異性檢測出牛源隱孢子蟲，解決了以往一次只能檢測一種隱孢子蟲亞型的問題，節約了檢測時間，便于大批量檢測。與巢式PCR相比，定量PCR反應敏感度高、耗時短，可以實時監測DNA的擴增操作。但試驗證明，在樣本中PCR抑制劑較多、卵囊相對較少的情況下，巢式PCR檢測方法比較理想。

3.1.4 反轉錄PCR（RT-PCR）。反轉錄PCR檢測是針對隱孢子蟲的mRNA進行檢測的，因此，mRNA的提取為該檢測技術的重點，其中卵囊破裂的強度被認為是影響mRNA提取質量的關鍵因素。Garces等［17］將磁珠法和異硫氰酸胍/酚/氯仿法進行對比，發現磁珠法能夠更好地打破卵囊壁并能保證mRNA的完整性，且靈敏度是異硫氰酸胍/酚/氯仿法的2.6倍以上。Jenkins等［18］采用定量實時冰凍病毒RT-PCR、半定量冷凍病毒RT-PCR、巢式PCR檢測卵囊，結果表明：定量實時冰凍病毒RT-PCR和半定量冷凍病毒RT-PCR可用于檢測卵囊含量較低的樣品（低于5個），敏感度較高；RT-PCR相較于巢式PCR不需要進行兩次PCR檢測樣品，節約了檢測時間。同時，由于RT-PCR在單個試管內即可完成檢測，這使得樣品被污染的可能性顯著降低。由于失活的隱孢子蟲不能產生mRNA，所以該技術不能對失活的隱孢子蟲進行檢測。但也正因如此，可利用RT-PCR的這一特點對隱孢子蟲的活性進行檢測，這對隱孢子蟲的亞型分析及跟蹤隱孢子蟲病的暴發有重要意義。

3.1.5 多重PCR。彭昊等［19］采用多重PCR成功檢測出微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲，此方法最低可檢測到1 g糞便中500個卵囊。Santin等［20］采用多重PCR方法鑒別賴氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲，但該方法檢測到的微小隱孢子蟲反應條帶為400 bp，安氏隱孢子蟲反應條帶為350 bp，條帶差異僅為50 bp。雖然多重PCR能夠特異性地檢測樣品且具有較高的敏感性，但在電泳鑒定時對所用Maker、瓊脂糖及結果辨識區分能力上要求較高。多重PCR與單一PCR不同，單一PCR只能檢測一種基因，而多重PCR可同時檢測多種基因型或者同一基因的不同基因亞型，極大地節約了成本及檢測時間。

3.1.6 聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）。Xiao等［21］在1991年首次采用PCRRFLP檢測隱孢子蟲亞型，先應用巢式PCR技術擴增隱孢子蟲18S rRNA基因，隨后采用SspⅠ和VspⅠ對擴增出的特異性片段進行酶切，成功鑒定了微小隱孢子蟲、貝式隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和蛇隱孢子蟲。王鶴磊［22］采用PCR-RFLP技術，將巢式PCR第二輪擴增產物利用限制性內切酶MboⅡ和SspⅠ進行酶切，并將Maker設置在500 bp，通過SspⅠ鑒別出安氏隱孢子蟲，隨后利用MboⅡ酶切，鑒別了芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲。PCR-RFLP技術改變了只能通過DNA測序才能鑒定牛源隱孢子蟲亞型的情況，并且具有快捷、敏感性高、便于大量操作等優點，為牛隱孢子蟲檢測提供了新方案。

3.2 環介導等溫擴增技術

Karanis等［23］在2007年首次應用環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）檢測隱孢子蟲，針對隱孢子蟲的GP60基因設計了特異性引物，并將擴增的189 bp產物進行凝膠電泳檢測特異性，與常規PCR對比敏感度，發現LAMP檢測限度為每個檢測管1個卵囊，而PCR檢測限度為每個檢測管1×105個卵囊。LAMP的建立節約了核酸擴增的時間，并且能夠檢測到卵囊含量低的樣本。袁忠英等［24］在2009年首次應用LAMP技術檢測牛隱孢子蟲，通過隱孢子蟲18S rRNA序列設計4條引物進行擴增，并使用SYBR GreenⅠ顯色檢測，隱孢子蟲卵囊特異性顯示為陽性。史亞東［25］對LAMP檢測體系進行了優化，減少了預變性和酶失活的步驟。優化后的LAMP節約了試驗時間，可以實時顯示檢測結果，并且避免了開蓋造成污染的可能。但是，LAMP對特異性的引物要求較高，否則易出現非特異性擴增，因此設計高特異性的引物是這個試驗成功的關鍵。

3.3 基因芯片技術

利用基因芯片技術可以檢測牛隱孢子蟲卵囊，也可檢測牛隱孢子蟲蟲種。Wang等［26］采用基因芯片與PCR對比，熒光標記片段，采用提前設計的基因型、亞基因型和不同種屬的隱孢子蟲的寡核苷酸探針進行雜交，發現基因芯片可以排除PCR中出現的假陽性，提高檢測的準確度。基因芯片相比PCR可以獲得更多的信息量，并且其特異性和靈敏度都很高［27］。基因芯片技術是一種檢測牛隱孢子蟲及其蟲種的前沿技術，但是該方法應用成本較高，暫不適合實際應用。

3.4 DNA測序技術

Laxer等［8］首次應用PCR檢測隱孢子蟲，并與DNA測序技術相結合鑒定基因型。DNA測序提供了一個準確的參考基因組序列庫，廣泛應用于牛隱孢子蟲檢測。這種技術能夠評估隱孢子蟲物種之間的基因組變異。但是，DNA測序技術的耗材相對較為昂貴，并且耗時較長，因此不適宜大批量檢測。

4 其他新興檢測技術

4.1 納米技術

納米技術克服了熒光標記不穩定的缺點。Singh等［28］使用半導體作為熒光標記檢測微小隱孢子蟲卵囊，發現量子點在長達5 min的連續紫外光激發下更具光穩定性。與有機熒光團相比，量子點對水樣中其他熒光物質的干擾減少了50%。

4.2 基于芯片技術的生物傳感器

Chang等［29］改進了表面等離子體諧振生物傳感器，首次將生物素化的單克隆抗體與隱孢子蟲卵囊結合形成結合物，通過離心分離的方法，使含結合物的緩沖液通過金屬膜。這讓目標物更加容易傳導至傳感器金屬表面，便于檢測人員實時獲得檢測結果，且敏感度較高。但是，由于緩沖液的折射率不一致，所以檢測結果會受到影響。Thiruppathiraja等［30］開發了一種基于夾心酶聯免疫傳感的檢測水樣中隱孢子蟲的電化學生物傳感器。夾心試驗的結構由金納米顆粒、一抗、卵囊和與金納米顆粒結合的二抗組成，卵囊檢測下限為3個/mL，具有極高的敏感度。該技術提高了分析性能，可實現實時檢測及高通量、快速分析，能夠減少資源浪費。但是，金納米價格較為昂貴，無法大范圍應用于臨床試驗。

5 展望

目前，隱孢子蟲對養牛業的危害越來越大，牛隱孢子蟲檢測技術也在不斷創新。但截至目前，沒有一種檢測技術是完美的。傳統的病原形態學檢測技術依賴于實驗室顯微鏡，檢測主觀性較強，敏感度低且無法確定亞型。分子生物學檢測是目前判斷牛隱孢子蟲及其亞型最常用的檢測技術，敏感度較高，較為經濟且適合大批量操作。最先進的納米技術更加敏感、耐用，具有很高的識別性，但是存在造價昂貴、操作時間過長等缺點。很多學者努力將PCR技術與新發展的芯片技術相結合，期待會有好的效果。經過幾十年的努力，隱孢子蟲的檢測技術從最早的病原病態學檢測技術，發展到分子生物學技術，以及目前的新興技術，逐步向著更敏感、快速、特異性的方向發展。優秀的檢測技術對于牛隱孢子蟲病的防治非常重要。筆者對牛隱孢子蟲檢測技術進行了匯總，希望能為今后牛隱孢子蟲的進一步研究提供理論依據，減少隱孢子蟲病對養牛業造成的危害。