microRNAs調節骨免疫微環境的研究進展

劉 暢，李 靜，江思婧，牟雁東Δ

(1.川北醫學院口腔醫學系，四川南充637600 ;2.四川省醫學科學院.四川省人民醫院口腔科，四川成都 610031)

臨床常用自體移植修復大面積骨缺損，然而術后存在一些嚴重并發癥。因而急需尋找具有良好生物安全性及成骨效能的生物替代材料。但生物材料植入后引起的宿主免疫反應決定著生物材料的命運。Arron和Choi兩位學者在2000年提出了“骨免疫”這一概念[1]，人們發現骨骼系統與免疫系統緊密相連，并互相作用，免疫細胞也是骨穩態的關鍵調節因素。因而研究者們將目光轉向研究能調節骨免疫微環境的生物材料。研究者們通過改進生物材料的化學性能、表面物理性能及在材料上加載生物因子[2]，賦予生物材料調節骨免疫微環境的能力。microRNAs是一類由21～25個核酸組成的單鏈非編碼小RNA，microRNAs占人類基因組的15%,調控至少30%的蛋白基因編碼。已有多種microRNAs作為生物因子被加載到骨組織工程的生物材料中，并在體內外實驗中均獲得了較好的成骨效果。卻鮮有報道microRNAs在骨組織工程中調節骨免疫微環境。

本綜述將討論生物材料植入后的宿主反應、巨噬細胞在骨愈合中的作用、靶向調節成骨細胞及巨噬細胞的microRNAs。試圖探尋將具備骨免疫微環境調節能力的microRNA作為生物活性因子加載到生物材料上，未來應用這一策略使生物材料植入體內后靶向調節骨免疫微環境，獲得更好的成骨效果。

1 生物材料植入后的宿主反應

生物材料植入體內后會發生一系列的反應，其中包括血液-材料相互作用、臨時基質形成、急性和慢性炎癥、肉芽組織發育、異物反應和纖維囊形成[2]。多種免疫細胞參與了生物材料植入后的免疫反應。生物材料植入后的納秒內，血液和間質液蛋白質自發吸附在生物材料表面，引起凝血級聯反應。同時觸發補體級聯反應，產生高濃度的C3a和C5a以募集粒細胞及單核細胞。凝血級聯反應產生的纖維蛋白網、激活的血小板，以及補體激活過程中釋放的炎癥介質，在生物材料表面形成臨時基質。隨后發生以植入部位存在多形核粒細胞為標志的急性炎癥。在植入2天內，多形核粒細胞迅速發生耗竭。肥大細胞通過釋放組胺及增強炎性的細胞因子也參與了急性炎癥。急性炎癥期釋放的大量細胞因子會募集單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞。隨后進入慢性炎癥期，單核細胞/巨噬細胞是參與炎癥演變的主要細胞。血液循環中的單核細胞被募集到植入物部位，并分化成巨噬細胞。在傷口愈合的過程中，巨噬細胞吞噬有害物質，并募集其它細胞到損傷部位，同時分泌各種生物因子促進傷口愈合。巨噬細胞具有高度可塑性，可響應局部微環境，分化為M1型促炎表型及M2型抗炎表型。巨噬細胞可以吞噬直徑5 μm的顆粒，但M1表型向M2表型轉化失敗加上吞噬顆粒較大時[2]，在白介素4、白介素13的刺激下巨噬細胞將形成異物巨細胞，異物巨細胞可以吞噬直徑高達100 μm的顆粒。并在急慢性炎癥消失后，通過識別具有巨噬細胞、血管、成纖維細胞及肌成纖維細胞的“肉芽樣組織”，形成肉芽組織。普遍認為肉芽組織是纖維囊形成的前體。免疫細胞導致各種促纖維因子的釋放，募集成纖維細胞和內皮細胞，導致纖維組織的形成。免疫細胞的調節功能對于植入物最終向骨再生發展，還是形成纖維囊具有重要作用。研究發現巨噬細胞M1型向M2型的轉化可減少纖維組織的生成[3]。進一步說明了調節免疫環境對于植入生物材料骨再生的重要性。

2 巨噬細胞對骨愈合的作用

骨髓為骨細胞和免疫細胞提供相同的微環境，以容納和共享相互關聯的細胞因子和信號通路，使兩類細胞骨代謝中緊密聯系和互相影響。盡管多種免疫細胞參與了骨組織中的免疫反應，但巨噬細胞通過分泌各種細胞因子發揮著最重要的作用。在骨愈合中發揮作用的巨噬細胞根據細胞來源分為骨巨噬細胞和炎癥巨噬細胞(后者由單核細胞分化而來)。在體內骨巨噬細胞緊鄰破骨細胞，并且骨巨噬細胞耗盡后影響了骨損傷的愈合，這說明骨巨噬細胞對于骨穩態具有重要作用。而炎癥巨噬細胞被認為是組織愈合期間主要的巨噬細胞來源。這些炎癥巨噬細胞具有高度的可塑性，可以通過M1、M2表型轉化，并分泌各類細胞因子影響骨愈合的過程。現有研究中，microRNAs主要通過調節巨噬細胞M1、M2表型轉化，從而影響成骨細胞，影響骨愈合過程。了解巨噬細胞在骨愈合中所發揮的作用，有利于探究microRNAs介導巨噬細胞影響骨愈合的具體機制。

2.1 M1型巨噬細胞干擾素、脂多糖以及巨噬細胞集落刺激因子可刺激巨噬細胞分化為M1表型。M1型巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6等細胞因子影響成骨過程。TNF-α可以介導MSC的定向遷移，通過核因子κB通路增強了骨形成蛋白2、核心結合因子α1等成骨相關基因的表達，提高了堿性磷酸酶活性促進基質礦化。而白介素6敲減的小鼠，骨組織損傷愈合延遲，組織礦化成熟能力減弱[4]。但TNF-α、白介素6也可以促進破骨細胞形成。總而言之，早期的促炎因子可能對成骨有利，但長期的炎癥反應會導致異物反應及纖維包裹，引起生物材料植入失敗及周圍骨組織吸收。

2.2 M2型巨噬細胞與M1型巨噬細胞相反，M2型巨噬細胞在成骨的中晚期起作用，誘導新骨及纖維組的形成。M2型巨噬細胞可分為M2a、M2b、M2c、M2d型，每一種亞型都有特有的表面標志和功能。M2a由白介素4、白介素13刺激產生，分泌大量精氨酸酶1、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)促進膠原纖維和成纖維細胞因子產生。M2b由IC/TLR聯合激動劑及IL-1R激動劑刺激產生，分泌大量白介素10,同時也分泌白介素1β、TNF-α、IL-6，起平衡炎癥環境的作用。M2c由白介素10刺激分化而來，產生大量白介素10及TGF-β，起控制炎癥、促進組織重建的作用。M2d巨噬細胞被認為是腫瘤相關巨噬細胞。M2型巨噬細胞通過釋放抗炎細胞因子促進了成骨反應。白介素10可以促進成骨細胞分化，在白介素10敲減的小鼠中觀察到骨形成減少，羥基磷灰石在體內外實驗中依賴白介素10促進骨形成[5,6]。TGFβ可以通過BMP信號通路刺激間充質干細胞成骨分化，以促進成骨。然而，TNF-α、TGF-β1和TGF-β3等因子的長期釋放導致會瘢痕組織的形成和傷口愈合過程延遲。

3 調節骨免疫微環境的潛在microRNAs

鮮有文獻報道將同時作用于成骨細胞及免疫細胞的microRNAs應用到成骨生物材料上。Marycz等將miR-21、miR-124加載到加入了氧化鐵的納米羥基磷灰石中，在磁場條件下觀察到，復合材料降低了脂多糖刺激巨噬細胞產生的炎性因子，提高了小鼠成骨細胞MC3T3-E1的成骨能力[7]。另一項研究利用靜電紡聚納米纖維支架加載兩種microRNAs:Let-7c和miR-124，在小鼠體內降低了M1/M2型巨噬細胞比例，促進了植入物與周圍組織的骨整合[8]。但這些研究都缺少microRNAs具體影響骨免疫微環境的機制研究。了解同時靶向成骨細胞及免疫細胞的microRNAs,以及具體的作用機制,有利于將這些microRNAs進一步應用于生物材料上，達到理想的成骨效果。

3.1 miR-21miR-21對于巨噬細胞的表型的調節具有組織異質性，對不同的炎性環境其作用也不一致，研究者認為miR-21在調節炎癥反應時起著動態作用。Nurrahmah等用脂多糖刺激RAW264.7后發現通過NF-κB通路升高了miR-21表達，并促進了白介素1β、TNF-α、白介素6等炎性因子的表達[9]。而另一些研究則展示了相反的效果。脂肪干細胞分泌的外泌體中含有miR-21,促進了巨噬細胞向M2型分化，并促進了小鼠血管再生[10],血管再生對于成骨也具有重要意義。有趣的是，IL-1β刺激骨髓間充質干細胞后，產生的外泌體中富含miR-21同樣促進了M2型巨噬細胞分化[11],這說明miR-21可能是調節成骨細胞、免疫細胞互相作用的重要介質。

miR-21作用于骨髓間充質干細胞時展現出了積極的促成骨作用。在骨質疏松的小鼠中miR-21表達水平降低，而成骨誘導的骨髓間充質干細胞中miR-21表達上升，并且在骨髓間充質干細胞中過表達miR-21可以通過抑制基因功能磷脂酶和張力蛋白同源物促進干細胞成骨分化,抑制其成脂分化[12]。同時，MiR-21被證明可以通過Smad同源物7-Smad同源物1/同源物5/同源物8-Runx2信號軸促進骨髓間充質干細胞成骨分化[13]。

3.2 miR-26a研究發現miR-26a靶向Kruppel樣因子4,抑制了巨噬細胞從M1型向M2型轉化[14]。也有研究報道miR-26a可以靶向大鼠巨噬細胞toll 樣受體3從而減輕炎癥[15]。

miR-26a的促成骨作用在眾多文獻中均已得到了驗證。在小鼠體內，慢病毒轉染的miR-26a促進了顱骨缺損的愈合[16]。通過靶向成紅細胞白血病病毒癌基因同源物2轉導因子調節BMP/Smad信號通路，miR-26a對于骨質疏松的小鼠也有積極的治療作用[16]。miR-26a可以靶向糖原合成酶激酶3β,調節wnt信號通路從而促進骨髓間充質干細胞成骨[17]。在骨組織工程中，miR-26a被搭載到不同的生物材料上，在體內外均得到了較好的成骨效果。

3.3 miR-29miR-29a可以靶向骨髓巨噬細胞細胞的破骨細胞分化因子，從而抑制破骨細胞生成；同時，miR-29a敲減的骨髓間充質干細胞成骨能力減弱，這在小鼠體內也得到了驗證[18]。miR-29a也被認為通過核因子κB通路提高了白介素1β、白介素6等促炎因子的釋放[19]。

3.4 miR-34a在小鼠的骨髓巨噬細胞中，miR-34a通過細胞因子信號轉導抑制因子3/信號轉導及轉錄激活子-1/信號轉導及轉錄激活子-6信號軸促進巨噬細胞M2極化[20]。脂多糖刺激巨噬細胞系RAW264.7后，miR-34a表達降低，過表達miR-34a后，通過把現象Notch同源物1降低了TNF-α等炎性因子的表達[21]。但在不同的組織(如心臟、肺巨噬細胞等)上，miR-34a對于免疫細胞的作用并不同。在人骨髓間充質干細胞中miR-34a可以通過靶向Dickkopf同源物，從而調節Wnt信號通路促進Runx2、骨鈣素等成骨相關因子表達[22]。用水凝膠傳遞miR-34a在體內外均證明了miR-34a的促成骨作用[23]。

3.5 miR-124在不同的體內外模型中，miR-124均抑制巨噬細胞向M1型分化，促進巨噬細胞向M2型分化，并釋放抗炎因子。MiR-124靶向了TNF 受體關聯因子、信號轉導因子和轉錄激活因子3等多個靶標發揮上述功能[24，25]。同時miR-124對于骨愈合也有積極的作用。在韌帶成纖維細胞中，miR-124通過用靶向GSK-3β，調節Wnt信號通路促進細胞成骨分化[26]。羥基磷灰石顆粒搭載miR-124后也展現出良好的成骨能力[7]。納米纖維支架傳遞miR-124可以增加植入物周圍M2型巨噬細胞表達，降低植入后纖維囊的產生[8]。MiR-124還可以抑制白介素6、TNF-α誘導的破骨細胞生成[27]。

3.6 miR-125aBanerjee等發現miR-125a在M2型巨噬細胞中高度表達，敲減miR-125a后促進了M1型巨噬細胞的分化，miR-125a通過直接靶向Kruppel樣因子3參與了巨噬細胞表型大的調節[28]。牙髓干細胞的外泌體富含miR-125a, 過表達的miR-125a直接靶向B 細胞κ 輕肽基因增強子抑制因子抑制NF-κB和Toll樣受體信號通路，促進巨噬細胞M2向分化，并釋放促成骨因子骨形成蛋白2[29]。這說明miR-125a可能在骨免疫微環境中起著重要作用。miR-125a還被發現可以通過Wnt信號通路促進脂多糖刺激后的人骨髓間充質干細胞成骨[30]。

4 總結與展望

microRNA可以作為調節骨免疫微環境的生物活性因子加載到生物材料上，通過這一策略研發靶向調節骨免疫微環境的生物材料，得到更理想的成骨效果。在microRNAs的選擇上，我們認為miR-21、miR-26a、miR-29、miR-34、miR-124、miR-125a可以作用調節骨免疫微環境的生物活性因子。盡管有的microRNAs在免疫和成骨調節上具有爭議，但植入體內的微環境比已知的機制更為復雜，仍需進一步驗證骨免疫的效果與發揮作用的機制。

盡管microRNAs在共同調節免疫細胞和成骨細胞方面具有較大潛力，但要將其實際應用到生物材料上仍然有很多限制，比如靶向性差、循環時間短和裸miRNA藥物可能產生脫靶效應。在組織工程中，已有多種含有細胞和無細胞的支架得到了應用，但仍需要探索更理想的支架材料搭載microRNAs，使其時序釋放、靶向局部骨缺損部位，最終達到理想成骨效果。