結核分枝桿菌Rv2107基因編碼蛋白PE22的原核表達及生物信息學分析*

李玉潔，楊雨婷，楊國平,2△

(大理大學:1.基礎醫學院醫學微生物學及免疫學教研室；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000)

結核病(TB)是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病，也是單一感染性病原體導致的最大死因[1]。WHO在《2021年全球結核病報告》中估計，2020年全球新增TB病例987萬例，因TB死亡病例達128萬例，TB仍對人類生命健康造成嚴重威脅。因此，尋找MTB特異性抗原以用于早期免疫學診斷對于TB的防治意義重大[1]。PE/PPE蛋白是MTB獨有的蛋白家族，參與MTB與宿主細胞間的相互作用，其編碼基因約占MTB整個基因組的10%，對MTB的毒力、抗原變異及免疫逃逸作用至關重要[2]。Rv2107基因編碼的PE22蛋白為PE蛋白家族成員之一，能夠抑制巨噬細胞的凋亡，從而增強恥垢分枝桿菌在巨噬細胞中的存活[3]，且PE22/PPE36蛋白復合物可能共同分泌并定位于細胞表面，作為血紅素受體發揮作用，競爭性地獲取宿主細胞鐵離子，最終有利于MTB的生長和致病[4]。上述研究表明，PE22可能作為MTB的毒力因子參與機體MTB感染過程中的抗原變異和免疫逃逸過程，但其生物學功能尚未得到證實。為此，本研究對Rv2107基因編碼的PE22蛋白進行原核表達與生物信息學分析，為PE22蛋白在MTB感染過程中發揮的免疫學功能及作為疫苗候選抗原的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒 卡介苗(BCG)菌株和pET-32a表達質粒均由大理大學基礎醫學院醫學微生物學及免疫學教研室保存并提供。

1.1.2主要試劑及儀器 大腸埃希桿菌(E.coli) DH5α菌株、E.coliBL21(DE3)菌株、DNA2000 Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒與Pro-light辣根過氧化物酶(HRP)化學發光檢測試劑均購于北京天根生化科技有限公司；pMD18-T載體購于北京Takara公司；T4 DNA連接酶購于上海Themo Fisher公司；限制性核酸內切酶EcoRⅠ、HindⅢ購于上海Fermentas公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、鎳離子金屬鰲合親和層析介質(Ni-NTA)、蛋白 Marker與小鼠抗組氨酸(his)標簽抗體均購于北京Solarbio公司；HRP標記的羊抗鼠免疫蛋白G(IgG)購于北京中杉公司。HZQ-X500大型恒溫振蕩器購于上海一恒科學儀器有限公司；ABI 2720 PCR儀、Nanodrop 2000微量紫外可見分光光度計均購于上海Themo Fisher公司；5804R冷凍高速離心機購于德國Eppendorf公司；Scientz-ⅡD超聲波細胞粉碎機購于寧波新芝生物科技股份有限公司；EV-180垂直電泳槽、Gel DocTMEZ全自動凝膠成像系統均購于上海Bio-Rad公司；Image Quant LAS 4000 mini化學發光成像系統購于杭州Ge Healthcare Bio Sciences Ab公司。

1.2方法

1.2.1Rv2107基因的PCR擴增及重組表達質粒PE22-pET-32a的構建 通過Primer Premier 5.0軟件對Rv2107的基因序列進行酶切位點分析及上下游引物設計，并交由昆明擎科生物公司合成。以BCG基因組(H37Rv中Rv2107基因與BCG完全一致)為模板，Rv2107-F(正向)：5′-GGAATTCATGTCCT TTGTG-3′為上游引物，Rv2107-R(反向)：5′-CCCAAGCTTTTAGAAACC-3′為下游引物，PCR擴增Rv2107基因。反應體系25 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，加雙蒸餾水(ddH2O)至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。Rv2107基因PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后連接至pMD18-T載體，熱擊轉入E.coliDH5α感受態細胞，經含氨芐青霉素的LB固體選擇培養基培養后PCR及雙酶切鑒定，對鑒定正確的重組質粒PE22-pMD18-T送昆明擎科公司測序鑒定。EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切測序正確的重組質粒PE22-pMD18-T及表達載體pET-32a，將于pMD18-T載體上酶切的Rv2107基因經T4 DNA連接酶連接至pET-32a載體，獲得重組表達質粒PE22-pET-32a后熱擊轉入E.coliDH5α感受態細胞，經含氨芐青霉素的LB固體選擇培養基培養后，挑取陽性單克隆菌落并PCR鑒定陽性菌落。提取重組表達質粒PE22-pET-32a后熱擊轉入E.coliBL21感受態細胞，獲得含PE22-pET-32a的BL-21菌株，并PCR鑒定陽性菌落。

1.2.2PE22蛋白的表達、純化及鑒定 含重組質粒PE22-pET-32a的BL-21菌株在200 r/min、37 ℃條件于含氨芐青霉素的LB液體培養基中振蕩培養過夜，次日以1∶100比例擴大培養至A600 nm值為0.6，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度0.5 mmol/L)誘導表達6 h后，離心收集菌體并超聲破碎，對上清及沉淀進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分析，檢測蛋白表達形式。將沉淀中以包涵體形式表達的PE22蛋白以8 mol/L尿素溶液溶解變性，采用Ni-NTA純化，經6、4、2、0 mol/L尿素溶液依次復性后，使用10、20、50 mmol/L咪唑溶液依次洗滌雜蛋白，以500 mmol/L咪唑溶液洗脫獲得目的蛋白。得到的純化PE22蛋白經SDS-PAGE電泳后，300 mA、65 min濕轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，經TBST緩沖液洗滌3次后，以小鼠抗his標簽抗體為一抗室溫孵育1 h后4 ℃孵育過夜，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育1 h，Pro-light HRP化學發光檢測試劑為顯影劑進行蛋白質印跡法(Western bolt)鑒定。

1.2.3PE22蛋白的生物信息學分析 通過Expasy ProtParam軟件分析PE22蛋白的理化性質，TMHMM Server v.2.0和SignalP 5.0 Server軟件預測PE22蛋白的跨膜區和信號肽，NetPhos-3.1軟件預測PE22蛋白的磷酸化位點，Motif Scan軟件預測PE22蛋白的翻譯后修飾位點，Cell-PLoc2.0軟件預測PE22蛋白的亞細胞定位，SOPMA軟件預測PE22蛋白的二級結構，SWISS MODEL軟件預測PE22蛋白的三級結構，ABCpred和SYFPEITHI軟件預測PE22蛋白的抗原表位。

2 結 果

2.1Rv2107基因的PCR擴增及重組表達質粒PE22-pET-32a的構建 以BCG基因組為模板進行PCR擴增，獲得大小約為297 bp的特異性片段，與預期一致，表明目的基因Rv2107擴增成功，見圖1A。連接Rv2107基因至pMD18-T載體獲得重組克隆質粒PE22-pMD18-T，并經EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后，獲得297 bp大小的清晰條帶，測序鑒定表明Rv2107的PCR產物與NCBI中NC_000962.3序列完全一致，表明重組克隆質粒PE22-pMD18-T構建成功，見圖1B。將PE22-pMD18-T重組克隆質粒上酶切下的Rv2107基因克隆至pET-32a表達載體，獲得含PE22-pET-32a的DH5α菌，經PCR陽性鑒定獲得297 bp大小的特異性片段，見圖1C。

A.Rv2107的PCR擴增產物(M為DNA Marker；1為PCR擴增產物)；B.重組克隆質粒PE22-pMD18-T的雙酶切鑒定(M為DNA Marker；1為PCR產物；2為雙酶切產物)；C.含重組表達質粒PE22-pET-32a的DH5α菌的菌落PCR鑒定(M為DNA Marker；1、2為陽性菌落的PCR產物)。

2.2PE22蛋白的表達、純化及鑒定 提取含重組表達質粒PE22-pET-32a的DH5α菌的重組質粒轉入E.coli BL21感受態細胞后，經0.5 mmol/L IPTG誘導表達及SDS-PAGE電泳分析得出，PE22蛋白以包涵體形式表達；誘導表達的PE22蛋白經Ni-NTA純化、500 mmol/L咪唑溶液洗脫后可見大小約為29 000的單一目的條帶，與預期一致，見圖2A。Western blot顯示，相對分子質量29 000大小位置處可見清晰條帶，見圖2B。

A.PE22蛋白的SDS-PAGE電泳分析(M為Marker；1為誘導沉淀；2為誘導上清；3為空載誘導沉淀；4為空載誘導上清；5為純化PE22蛋白)； B.Western blot鑒定PE22蛋白(M為Marker；1為PE22蛋白)。

2.3PE22蛋白的生物信息學分析

2.3.1PE22蛋白的一般理化性質 通過Expasy ProtParam軟件對PE22蛋白的理化性質進行分析，結果顯示PE22蛋白的相對分子質量為10 373.77，理論等電點為6.82，分子式為C463H722N126O139S3，由98個氨基酸組成，其中丙氨酸(Ala)占17.3%，纈氨酸(Val)占10.2%，絲氨酸(Ser)占9.2%，帶正電荷的氨基酸殘基(Asp、Glu)總數為7，帶負電荷的氨基酸殘基(Arg、Lys)總數為7。PE22蛋白的脂肪族氨基酸指數為81.18%，在A280 nm波長處消光系數為4470，不穩定指數為23.29，屬于穩定蛋白，親水性平均系數為0.121。通過ProtScaleon Expasy軟件對PE22蛋白的親疏水性進行分析，結果顯示單個氨基酸的親水系數最小值為-1.722，最大值為1.733，預測PE22蛋白為疏水性蛋白。見圖3。

圖3 PE22蛋白親疏水性預測

2.3.2PE22蛋白的跨膜結構、信號肽、磷酸化位點及翻譯后修飾位點 通過TMHMM Server v.2.0軟件對PE22蛋白的跨膜結構進行預測，結果顯示PE22蛋白無跨膜區，為非跨膜蛋白。見圖4。

圖4 PE22蛋白跨膜區預測

通過SignalP 5.0 Server軟件對PE22蛋白進行信號肽預測，結果顯示PE22蛋白N端無信號肽序列，為非分泌蛋白，可能不發生跨膜轉移，只于合成處發揮作用。見圖5。

圖5 PE22蛋白信號肽預測

通過Cell-PLoc 2.0軟件對PE22蛋白進行亞細胞定位預測，結果顯示PE22蛋白定位于細胞壁,可能為MTB表面細胞壁蛋白，介導MTB與宿主細胞間的相互作用；通過NetPhos-3.1軟件對PE22蛋白的磷酸化位點進行預測，結果顯示PE22蛋白含4個絲氨酸磷酸化位點，4個蘇氨酸磷酸化位點，1個酪氨酸磷酸化位點。見圖6。

圖6 PE22蛋白磷酸化位點預測

通過Motif Scan軟件對PE22蛋白的翻譯后修飾位點進行預測，結果顯示PE22蛋白含有N-豆蔻酰化位點(10～15、22～27位)、蛋白激酶A磷酸化位點(49～52位)、蛋白激酶C磷酸化位點(36～38、48～50位)，磷酸化有利于蛋白質的活性與功能并可催化蛋白質間的相互作用，表明PE22蛋白可能通過調控宿主細胞生命活動發揮生物學功能。

2.3.3PE22蛋白的二、三級結構 通過SOPMA軟件對PE22蛋白的二級結構進行預測，結果顯示PE22蛋白含α-螺旋(Hh)結構70個，占71.43%，無規則卷曲(Cc)結構16個，占16.33%，β-轉角(Tt)結構7個，占7.14%，延伸鏈(Ee)結構5個，占5.10%，見圖7，其無規則卷曲含量較高，表明PE22蛋白容易與抗體嵌合，從而發揮抗原作用。

圖7 PE22蛋白二級結構預測

通過SWISS MODEL軟件對PE22蛋白序列進行分析，以PE25-PPE41-EspG5三聚體復合物為模板構建PE22蛋白的三級結構同源模型，見圖8。其Hh含量較高，與蛋白的二級結構預測相符，GMQE(全球性模型質量評估)值0.68，QMEAN(定性模型分析)值0.73。

圖8 PE22蛋白同源建模三級結構

2.3.4PE22蛋白的抗原表位 通過ABCpred軟件對PE22蛋白序列進行分析，結果顯示PE22蛋白含有10個B細胞抗原表位(臨界值0.68)。見表1。

表1 PE22蛋白B細胞抗原表位預測

續表1 PE22蛋白B細胞抗原表位預測

通過SYFPEITHI軟件對PE22蛋白序列進行分析，結果顯示PE22蛋白含有13個T細胞抗原表位(臨界值13)。見表2。

表2 PE22蛋白T細胞抗原表位預測

通過SYFPEITHI軟件對PE22蛋白序列進行分析，結果顯示PE22蛋白含有12個限制性CTL細胞表位(臨界值16)。見表3。

表3 PE22蛋白CTL細胞抗原表位預測

3 討 論

TB是威脅人類生命健康的重要公共衛生問題之一，篩選MTB特異性抗原，建立快速、敏感的生物分子診斷檢測可輔助篩查TB，有效控制TB的傳播，具有十分廣闊的發展前景[5]。而生物信息學以基因組DNA序列信息為源頭模擬蛋白質空間結構，從而預測特定蛋白的功能，可有效篩選特異性抗原，已廣泛應用于多種疾病的診斷與藥物、疫苗的研發[6-7]。

研究表明，Rv2107基因編碼的PE22蛋白可通過參與MTB對宿主細胞鐵離子的攝取，促進機體MTB的生長和致病，誘導機體產生免疫應答，可能具有較強的免疫原性，有望成為TB疫苗的靶點。因此，進一步分析PE22蛋白在Mtb感染過程中的作用機制可為TB的防治提供新的思路[8-9]。本實驗將經PCR擴增的Rv2107基因克隆至表達載體pET-32a，并經PCR陽性鑒定證實重組質粒PE22-pET-32a構建成功，且含重組質粒PE22-pET-32a的BL21菌株表達蛋白以包涵體形式存在。而生物信息學分析顯示，PE22蛋白為疏水性蛋白，這也與原核表達獲得包涵體形式表達的PE22蛋白一致。研究表明，E.coli大腸桿菌內不溶性蛋白質顆粒大量積累、聚集、折疊不完全而形成的包涵體，由于包埋了酶攻擊的位點，可以最大限度地抵抗宿主細胞蛋白酶的攻擊，有效發揮抗原作用；研究表明，蛋白的磷酸化修飾可影響包括蛋白酶活性調節、蛋白構象改變、蛋白相互作用、蛋白穩定性及連接其他蛋白分子能力在內的細胞生命活動的所有過程，而PE22蛋白含有的多個磷酸化位點及翻譯后修飾位點顯示PE22蛋白可能參與調控宿主細胞信號傳導通路的磷酸化狀態，介導細胞間的信號轉導過程[10-11]；蛋白跨膜區、信號肽及亞細胞定位分析表明PE22蛋白為細胞壁相關蛋白，暴露于細菌表面，無跨膜區與信號肽，可能通過促進MTB與宿主間的相互作用促進機體MTB的擴散。這些研究提示，PE22蛋白可能具有較強的免疫原性，通過激活機體免疫反應發揮免疫防御效應。此外，蛋白二級結構分析表明PE22蛋白含有大量Hh (71.43%)與Cc (16.33%)結構，其中Hh模體為保守序列，在DNA結合基序中發揮重要作用，Cc多含有B細胞優勢抗原表位，有利于蛋白質與抗體的嵌合[12-13]；抗原表位綜合分析表明，PE22蛋白含有多個B細胞、T細胞抗原表位，其中B細胞抗原表位可與游離的抗體分子結合激活機體體液免疫，T細胞抗原表位可與機體T淋巴細胞表面的抗原受體結合激活細胞免疫，這些分析提示PE22蛋白可作為潛在抗原用于免疫診斷或TB疫苗的研究[14]。而由于預測軟件的局限性和機體免疫反應的復雜性，PE22蛋白在MTB感染過程中發揮的作用尚不明確，但可以此為參考推測蛋白的功能并篩選出新的抗原靶位，用于新型結核疫苗的研制。

綜上所述，重組表達質粒PE22-pET-32a轉入BL21菌株后可經IPTG誘導、親和層析法純化得到重組蛋白PE22，為進一步研究蛋白的生物學功能提供基礎。而生物信息學分析表明PE22蛋白具有較強的免疫原性，可通過激活機體免疫反應發揮抗MTB感染作用，并作為優勢抗原用于TB早期診斷或候選疫苗的研究。后續將通過研究PE22蛋白對巨噬細胞功能的影響進一步分析PE22在MTB感染過程中發揮的作用，以期有助于TB的防治。