兵團第十四師四十七團設施蔬菜根結線蟲種類鑒定*

馬少軍，劉佳偉，金玉華，李克梅*

（1.新疆農業大學農學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆生產建設兵團第十二師農業科學研究所）

根結線蟲（Meloidogyne spp.）在世界各地廣泛分布，寄主范圍廣，幾乎能夠侵染所有的蔬菜作物，常造成嚴重的經濟損失[1]。迄今，全世界已報道100多種根結線蟲，常見的根結線蟲種類主要是南方根結線蟲（Meloidogyn incognita）、爪哇根結線蟲（M.javanica）、花生根結線蟲（M.arenaria）與北方根結線蟲（M.hapla）[2]。新疆兵團第十四師四十七團地處新疆較溫暖的和田地區墨玉縣，光熱資源充足，冬季無嚴寒，開春早，降水少，具有發展設施農業得天獨厚的自然條件。四十七團有設施大棚500 多座，主要種植番茄、辣椒和十字花科蔬菜，還有部分黃瓜、豇豆、芹菜等蔬菜。新疆地處中國西北邊陲，冬季氣候寒冷，并不利于根結線蟲在室外越冬，很長時間以來，未見根結線蟲在新疆大面積危害的報道。但設施農業的保溫條件好、復種指數高、栽培模式單一，有利于土壤中根結線蟲繁殖積累，為新疆設施作物根結線蟲病的發生提供了適宜環境[3]，蔬菜根結線蟲病已逐漸成為當前新疆設施蔬菜主要病害之一，嚴重影響蔬菜的產量和品質。

全俊仁[4]等首次發現在新疆石河子溫室中北方根結線蟲（M.hapla）侵染危害辣椒。杜蘭英[5]等報道根結線蟲病在新疆哈密危害大棚、溫室的黃瓜、番茄、茄子等蔬菜，并提出病害防治建議，但未明確根結線蟲的種類。李克梅[6]等報道新疆阿克蘇、吐魯番和庫爾勒等地區危害蔬菜的為南方根結線蟲與北方根結線蟲的混合種群。本研究鑒定了根結線蟲病新發生地四十七團設施蔬菜根結線蟲的種類，研究結果可為該地蔬菜根結線蟲病的來源追溯及其病害綜合防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年9月至2021年5月在第十四師四十七團大棚中采集4批15份蔬菜根結線蟲病病株（其中番茄8份，豇豆2份，黃瓜3份，芹菜2份），流水清洗干凈，放置于4 ℃冰箱中備用，從每個病株中隨機挑取20個白色雌蟲和20個卵囊，以備后續使用。

1.2 根結線蟲會陰花紋的觀察

雌蟲會陰花紋玻片的制作參照謝輝[7]的方法，即在解剖鏡下，滴加45%乳酸至載玻片中央做浮載劑，將根結線蟲成熟雌蟲移入其中，用手術刀切取蟲體后部角質膜，清除內部附著物，再將其移至另一滴干凈的45%乳酸液滴中清洗和修正，加蓋玻片，置顯微鏡下觀察拍照。將觀察的會陰花紋形態特征與文獻資料對比，初步鑒定根結線蟲種類。

1.3 常見根結線蟲特異性引物PCR檢測鑒定

1.3.1 單條線蟲DNA的提取

解剖鏡下挑取孵化的單條根結線蟲二齡幼蟲放入含有8 μL ddH2O的PCR管中，繼而置液氮冰凍2 min，65 ℃溫育1 min，重復3個循環后，再加入1 μL蛋白酶K和1 μLBuffer，65 ℃保溫90 min，95 ℃加熱10 min。得到的線蟲DNA可用于進一步的PCR或于-20 ℃保存備用。

1.3.2 特異性引物PCR擴增鑒定常見根結線蟲

對4種常見的根結線蟲檢測鑒定，分別采用Randig[8]等報道的特異性引物Inc-K14-F和Inc-K14-R檢測南方根結線蟲，Petersen[9]等報道的特異性引物Fh和Rh檢測北方根結線蟲，Fargette[10]等報道的特異性引物Far和Rar、Fjav和Rjav分別擴增檢測花生根結線蟲和爪哇根結線蟲（表1）。統一采用25 μL的反應體系：12.5 μL 2×Easy Taq Mix，引物各2 μL，根結線蟲DNA模板1 μL，ddH2O7.5 μL。擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、退火溫度（上述4種根結線蟲分別是64 ℃、58 ℃、61 ℃、64 ℃）40 s、72 ℃延伸1.5 min，變性、退火、延伸循環反應40次，72 ℃保溫10 min。電泳檢測擴增產物，在紫外照膠儀上觀察并拍照。

表1 本研究所用引物信息

2 結果與分析

2.1 發病癥狀

蔬菜根結線蟲病從苗期到成株期均可發生。受害植株地上部生長緩慢，葉片變小，變黃。結實少，甚至不結實，果實發育緩慢，嚴重時植株停止生長，植株早衰。根結線蟲寄生在蔬菜根內，病根部膨大，形成畸形根結，根結外部通常附著有大量膠質狀卵囊（圖1A）。解剖根結，可見近球形或長橢圓形的雌蟲，雌蟲有突出的短頸，乳白色，陰門和肛門位于末端，無尾（圖1B）。

圖1 番茄根結線蟲病根癥狀及根結線蟲雌成蟲蟲態

2.2 根結線蟲的形態學鑒定

切取成熟雌蟲的會陰花紋，在生物顯微鏡下觀察，發現供試根結線蟲會陰花紋背弓比較高，似乎方形；側區側線清楚、光滑，線紋斷裂分叉形成刻痕；線紋由細到粗，呈“Z”形（圖2）。與南方根結線蟲（M.incognita）的會陰花紋相似[1]。

圖2 供試根結線蟲成熟雌蟲會陰花紋

2.3 特異性引物PCR檢測鑒定

用特異性引物PCR擴增檢測采集保存的根結線蟲群體，其中以Inc-K14-F/Inc-K14-R為引物（檢測南方根結線蟲）的樣品中擴增出400 bp左右的條帶，而引物Fh/Rh（檢測北方根結線蟲）、Far/Rar（檢測花生根結線蟲）和Fjav/Rjav（檢測爪哇根結線蟲）在不同的樣品中均沒有擴增出特異性條帶（圖3）。

圖3 根結線蟲經特異性引物擴增的電泳圖譜

3 結論與討論

本文通過比對根結線蟲成熟雌蟲的會陰花紋形態特征，結合特異性引物PCR擴增檢測，將來自兵團第十四師四十七團的15個設施蔬菜根結線蟲群體均鑒定為南方根結線蟲，而未見其它根結線蟲種類。

蔬菜根結線蟲病在世界各地廣泛分布危害。自然條件下，4種常見根結線蟲中，北方根結線蟲主要分布在寒溫帶地區，而其他3種則主要分布在熱帶地區，其中對農作物危害最嚴重的是南方根結線蟲[11-12]。關于根結線蟲的鑒定常采用形態觀察結合同工酶技術等方法。王暄[13]等通過形態觀察和同工酶分析，報道了中國根結線蟲新紀錄種——西班牙根結線蟲。柳永娥[14]等通過雌蟲會陰花紋觀察與蘋果酸脫氫酶和酯酶測定相結合的方法，鑒定了甘肅省白銀市保護地蔬菜根結線蟲病的病原有2種，為南方根結線蟲和爪哇根結線蟲，其中優勢種群為南方根結線蟲。但是上述方法往往會受限于蟲態的發育階段，供試線蟲需要量大且需要技術人員有較高的專業水平，耗時較長。而采用雌成蟲會陰花紋特征結合特異性引物PCR擴增技術的鑒定方法得到越來越多的應用。楊艷梅[15]等采用雌成蟲會陰花紋形態觀察及分子生物學檢測（rDNA-ITS區和SCAR特異性鑒定）技術，鑒定了云南省部分煙區根結線蟲種類，主要有南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲，其中花生根結線蟲為優勢種群。羅佳[2]等用該技術將重慶番茄根結線蟲病的病原鑒定為南方根結線蟲。

我國已報道作物根結線蟲40余種，本研究僅對4種常見根結線蟲進行鑒定，明確危害四十七團設施蔬菜的根結線蟲為南方根結線蟲，暫未發現其它根結線蟲種類。關于新疆設施蔬菜根結線蟲的種類和分布還需要在今后的工作中加強監測，尤其在種苗調運過程中需加強檢疫，防止其它種類根結線蟲的人為傳播。