響應面法優化蒼術揮發油提取工藝及其抑菌活性研究＊

趙 彪，張科藝，馬文敏，王 洋

（1.商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.商洛學院商洛市中藥材病蟲害綜合防治技術研究中心，陜西 商洛 726000；3.商洛學院陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西 商洛 726000；4.東北農業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

蒼術是菊科植物茅蒼術（Atractylodes lancea（Thunb.）DC.）或北蒼術（Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.）的干燥根莖，作為中國著名的野生中藥材，始載于《神農本草經》，被列為上品[1]。蒼術主要含蒼術素、蒼術醇、β-桉葉醇、蒼術內酯、茅術酮等揮發性成分[2-4]，司燥濕健脾、明目之功，主治濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、腳氣痿躄、風濕痹痛、風寒感冒、夜盲和眼目昏澀[1，4]。蒼術揮發油內含多種藥理活性成分[5]，本研究以蒼術為主材料，對其揮發油的提取工藝進行研究。蒼術揮發油的提取在中藥制劑和生產中是一個難點。中國揮發油提取的傳統方法為水蒸氣蒸餾法，但其提取需高溫蒸餾，導致揮發油中含有的熱不穩定成分損失較多，嚴重影響其藥用活性?，F今揮發油提取技術趨向于多技術聯用[6]，故本研究擬用減壓輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發油，通過調控真空度，降低溶劑水的沸點，使其處于低溫沸騰狀態，從而減少熱不穩定成分的損失。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

蒼術（產地：商洛，購于致天然旗艦店）；紅四氮唑（TTC），飛凈生物科技有限公司；無水硫酸銅，天津市大茂化學試劑廠；MH肉湯，海博生物技術有限公司；可溶性淀粉，天津市致遠化學試劑有限公司；瓊脂粉，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋（ANYO），旋轉蒸發儀（EYELAN-1001），高低溫震蕩培養箱（HZQ-F160C型），紫外分光光度計（美析UV1100），超凈工作臺；手提式中藥粉碎機，電子天平（舜宇FB323），標準檢驗篩。

2 方法

2.1 蒼術揮發油單因素條件的篩選

將用于測定的供試品粉碎，后過2-3號篩。以水蒸氣蒸餾法聯用減壓技術建立最佳提取工藝，主要考察輔助壓力、液料比、提取溫度、提取時間4個因素對揮發油產率的影響[7]，以各項中最優條件作為后續的提取條件，每組3次重復。

輔助壓力的單因素實驗：稱取20 g蒼術粉置于圓底燒瓶中，加入10倍體積的水，輔助壓力分別設置為0.1 MPa、0.09 MPa、0.08 MPa、0.07 MPa、0.06 MPa、0.05 MPa，在90℃下蒸餾5.0 h，餾出液加入5 g無水硫酸鈉，抽濾后回收溶劑，稱量質量，并計算揮發油得率[8]。

參照輔助壓力實驗，分別在1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的液料比下，50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的溫度梯度下，1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h的時間梯度下，進行單因素實驗。

2.2 Box-Behnken設計響應面優化提取工藝

2．2．1 響應面實驗因素及水平確定

根據單因素實驗結果，選取對揮發油產率影響較大的3個因素及每一因素的前3個水平作為響應面設計的三因素三水平。

2．2．2 Box-Behnken實驗設計方案

將確定的三因素三水平輸入Design-Expert 8.0.6 Triar軟件的Box-Behnken中心組合設計中，根據Box-Behnken原理得到實驗方案，依照方案進行實驗。

2．2．3 響應面的優化分析及驗證

以蒼術揮發油產率為響應值，進行二次響應面回歸分析，得回歸方程，方程中各項系數的正負反映各因素對響應值的影響方向，絕對值大小反映影響程度[9-10]。響應曲面坡度越大，則對響應值的影響越大。開口朝下，表明該因素發展水平具最優值，可進行響應優化。等高線圖是曲面上相同的因素值在底面上形成的曲線，等高線越趨近于正圓，則兩因素的交互作用越小；等高線越趨近于橢圓，則兩因素的交互作用越大。等高線的密集程度反映了該因素對產油率的影響程度，等高線越密集，對出油率的影響就越大[11]。

2.3 抑菌活性測定

配置256 mL/L藥液、肉湯培養基（含TTC），將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后分別接種，37℃恒溫振蕩培養20 h，紫外分光光度計測量細菌濃度，使菌懸液OD600=0.5。將菌懸液稀釋100倍。在96孔板上采用二倍稀釋法配置系列濃度溶液[12]，依次加入2種稀釋菌懸液，培養12 h，觀察孔板顏色，確定最小抑菌濃度MIC。

3 結果

3.1 單因素實驗結果

由各單因素對產率影響結果可知，蒸餾時間在2.5 h后對產率影響較小，故選擇3.0 h作為提取時間；選取輔助壓力0.06～0.08 MPa、料液比1∶6～1∶10、溫度60～80℃作為后續Box-Behnken響應面法優化數據。

3.2 響應面實驗因素及水平確定

根據單因素實驗結果，設定提取時間為3.0 h，選取對蒼術揮發油產率影響較大的輔助壓力、料液比、溫度3個因素，確定三因素三水平，因素水平表如表1所示。

表1 蒼術揮發油提取的響應面實驗因素水平表

3.3 響應面實驗方案及結果

以蒼術揮發油產率作為響應值，Box-Behnken中心組合設計方案及結果如表2所示。

表2 BOX-Behnken實驗設計及結果

3.4 模型建立與回歸分析

運用Design-Expert軟件，以蒼術揮發油產率為響應值，進行二次響應面回歸分析，獲得回歸方程：蒼術揮發油產率=2.61-1.375×10-3A-0.026B-0.26C+4.5×10-3AB+0.15AC-0.072BC-0.29A2-0.28B2-0.38C2，由該方程可知提取溫度對響應值的影響大于輔助壓力、大于料液比，該二次項系數均為負值，則方程圖像開口向下，具有最高點，故能進行優化。

蒼術揮發油提取回歸模型的顯著性檢驗結果如表3所示。

由表3知，該模型的F值為69.01、P小于0.000 1，表明模型是極顯著；C、A2、B2、C2對響應值P均小于0.000 1，說明C、A2、B2、C2對模型具有極顯著的影響，交互項AC、BC的P值小于0.05，說明對模型具有顯著的影響。矢擬項Prob大于F值，為0.458 3，大于0.05，說明擬合的回歸曲線符合實際情況，可以用此模型分析和預測蒼術揮發油的提取率。

表3 蒼術揮發油提取回歸模型的顯著性檢驗結果

表3（續）

由方差分析表4知，R2=0.988 9＞0.9、校正R2=0.974 5，表明該模型與實際擬合較好，該回歸曲線可以反映97.45%的響應值變化。變異系數2.71%，表明模型能較好地反映真實的實驗值。

表4 蒼術揮發油提取回歸模型方差分析

3.5 等高線與響應面分析

由等高線圖知，料液比、輔助壓力和提取溫度之間存在交互作用，各因素交互對蒼術揮發油產率的影響依次為提取溫度、輔助壓力、料液比。

由響應曲面圖結合回歸方程得到最佳提取參數：料液比1∶7.82、輔助壓力0.07 MPa、提取溫度66.4℃、蒸餾3 h，理論提取率可達2.653%。結合實驗的可行性，將理想提取參數調整為料液比1∶7.8、輔助壓力0.07 MPa、提取溫度66.5℃、提取時間3 h。

3.6 最佳提取工藝的驗證

在上述條件下進行3次重復試驗，得到蒼術揮發油平均產率為2.584%，RDS為1.534%，相對誤差1.376%，表明該模型具備較好的穩定性。

3.7 抑菌活性測定

由96孔板顏色知，蒼術揮發油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性顯著，其MIC值僅為4 mL/L；對大腸桿菌具有一定的抑菌活性，其MIC值為128 mL/L。

4 總結

本研究采用減壓輔助水蒸氣蒸餾法，通過單因素實驗和響應面法優化蒼術揮發油的提取工藝，得到在料液比1∶7.8、輔助壓力0.07 MPa、提取溫度66.5℃下蒸餾3 h，可使蒼術揮發油平均產率達2.584%，工藝穩定性較好。

該工藝在水蒸氣蒸餾法的基礎上減壓輔助，可有效減少熱不穩定活性成分的損壞，使有效成分較好的保留，縮短蒸餾時間，且產物活性較優于常壓提取，可為蒼術揮發油生產提供理論依據。