天津地區黃瓜中風險性食源性致病菌污染水平分析

于海濤，劉 娜，李瑞環，徐石勇，黃鳳軍，趙 新

（1.天津市農業科學院 種質資源與生物技術研究所，天津 300381；2.天津市東麗區產品質量監督檢驗所，天津 300300）

隨著消費者生活水平的提高以及日常飲食習慣的多樣化，食品安全問題日漸成為社會關注的焦點[1]。據世界衛生組織（WHO）統計，在全球范圍內每年約6億人患食源性疾病，因其導致死亡的人數約42萬人[2]。研究表明，微生物也是我國食源性疾病的主要誘發因素，其潛在的食品安全隱患不容忽視[3-5]。

食源性致病菌在自然界分布廣泛，近幾年國內外已發生多起由食源性致病菌引起的生物安全事件[6-11]。例如，2016年美國因黃瓜暴發沙門氏菌疫情[12]，導致至少907人感染，其中6人死亡，204人住院。2000年日本金黃色葡萄球菌腸毒素導致的“血印乳品”事件[13]，14 000多人受感染，國內外金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒每年都有發生[14]。由此可見食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素，因此調查即食生鮮果蔬中的病原微生物顯得尤為重要。

黃瓜作為北方居民餐桌上常見的蔬菜，多以生食為主，因其營養豐富，深得廣大消費者的喜愛。由于其表面不光滑，紋路較多，很容易寄生各種細菌，另外黃瓜生長期較短，成熟過程中需要的肥料、灌溉水和土壤也是黃瓜中的食源性致病菌的主要來源[15-19]。因此，加大對黃瓜及種植投入品中的食源性致病菌篩查也十分重要。

本研究通過采集天津地區生產環節和市場環節的黃瓜樣本，對其進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的測定，確定天津地區黃瓜的主要風險因子為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，由于國內外至今暫未發布沙門氏菌的定量檢測標準，本研究僅對有定量檢測標準的金黃色葡萄球菌進行監測，通過應用IPMP 2014對金黃色葡萄球菌構建預測生長模型[20]，通過@Risk6風險評估軟件對其進行QMRA污染水平分析[21-22]，最終提出合理性建議，保證消費者的食用安全。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2017—2019年，在天津市西青區選擇2個黃瓜生產基地作為采樣點，按照無菌采樣原則采集60份黃瓜樣本及38份基質、井水、營養液等基地交叉污染樣本。并在天津市南開區、河西區、河北區、河東區、西青區和東麗區的大型農貿市場，按無菌采樣原則隨機采集黃瓜樣本98份。以上樣品均用無菌袋封閉，放于低溫樣品箱中保存，在6 h內運至實驗室，24 h內完成檢測。

1.2 培養基與儀器設備

緩沖蛋白胨水（BPW），四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，亞硫酸鉍（BS）瓊脂，HE瓊脂，木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂，生化鑒定試劑盒；7.5%氯化鈉肉湯，血瓊脂平板，Baird-Parker瓊脂平板；李氏增菌肉體LB（LB1，LB2），1%鹽酸吖啶黃溶液，1%萘啶酮酸鈉鹽，PALCAM瓊脂，生化鑒定試劑盒；改良EC肉湯，改良山梨醇麥康凱瓊脂，大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂，生化鑒定試劑盒等均購自北京陸橋技術有限責任公司。

拍擊式均質器（上海之信儀器有限公司），全自動高壓滅菌鍋（日本YAMATO有限公司），電熱恒溫培養箱（上海一恒有限公司），電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），電動移液器（Thermo有限公司），生物安全柜（ESCO公司），超凈工作臺（蘇州金燕凈化設備有限公司），OLYMPUS CX31顯微鏡（奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 致病菌篩查 黃瓜及基地交叉污染樣本中沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定分別基于國家標準GB/T 4789.4—2016，GB/T 4789.10—2016，GB/T 4789.30—2016，GB/T 4789.36—2016[23-26]。

1.3.2 膳食問卷調查 針對天津地區的居民設計1份調查問卷，采用隨機發放的原則選取100人進行膳食調研，問題包括購買黃瓜后當天食用量、存放溫度、存放時間、家庭用餐人數、人均每餐食用量、人均每星期黃瓜食用次數、常去攤位日銷量，由此了解天津地區居民對黃瓜的消費情況。

1.3.3 預測模型構建 無菌環境下將黃瓜切成小丁，紫外滅菌30 min，稱取20 g于無菌均質袋中，再用無菌吸管吸取1 mL濃度為2×104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌均勻的接種于均質袋中的黃瓜丁上，使黃瓜丁的帶菌量為1×103CFU·mL-1。將接種后的黃瓜丁分別放于10、15、20、25、30、35℃的培養箱中培養，按照預定時間間隔取樣，進行菌落計數。應用IPMP 2014中的Huang Model對試驗數據進行生長曲線的擬合，建立一級預測模型，其中一級預測模型（Huang Model）的表達式為：

式中，t，時間(h)；Y(t)，t時的菌數(ln CFU·g-1)；Y0，初始菌數(ln CFU·g-1)；Ymax，最大菌數(ln CFU·g-1)；μmax，最大比生長速率(ln CFU·g-1·h-1)；λ，延滯期時間（h）；α，延滯期變異系數為4。

應用IPMP 2014中的Arrhenius-type對金黃色葡萄球菌的最大比生長速率與溫度進行生長曲線的擬合，建立二級預測模型，其中二級預測模型（Arrhenius-type）的表達式為：

式中，μmax，最大比生長速率(ln CFU·g-1·h-1)；T，特定生長溫度(℃)；R，氣體常數（8.134 J·mol-1）；△G’，與細菌生長有關的一種動能；a和n，模型的參數。

1.3.4 污染水平分析 為便于計算，當黃瓜試樣中金黃色葡萄球菌濃度低于最低檢出限時，假設金黃色葡萄球菌菌量為最低檢出限的50%(5 CFU·g-1)。定性陽性，而定量為陰性的黃瓜試樣，實際待菌量低于10 CFU·g-1時，假設金黃色葡萄球菌菌量為10 CFU·g-1。結合IPMP 2014構建的一級模型、二級模型及膳食調查結果，獲得不同溫度條件下金黃色葡萄球菌的最大比生長速率。應用@Risk 6風險評估軟件設置變量參數，進行黃瓜中金黃色葡萄球菌定量風險評估，結合現有數據分析黃瓜中金黃色葡萄球菌污染水平。

2 結果與分析

2.1 篩查結果

對采集的黃瓜樣本及基地交叉樣本進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7篩查，經檢驗僅市場環節的黃瓜中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的檢出，金黃色葡萄球菌檢出比例為2/196，污染量分別為210、3 000 CFU·g-1；沙門氏菌檢出比例為1/196。致病菌篩查結果如表1所示。

表1 天津地區黃瓜中致病菌篩查結果

2.2 膳食調查結果

根據天津地區居民食用黃瓜的消費習慣，并結合@Risk 6軟件對風險因素的分析，設置7道問題，隨機抽取100人進行調研，具體匯總結果如表2。

表2 問卷調研結果匯總

2.3 預測模型構建

通過建立不同溫度條件下黃瓜中金黃色葡萄球菌的生長模型，每隔一定的時間進行沙門氏菌定量檢測，獲得其在10、l5、20、25、30、35℃下的生長數據，應用IPMP軟件進行擬合，以定量描述特定環境條件下對金黃色葡萄球菌在黃瓜上的生長、殘存和死亡動態，從而對金黃色葡萄球菌的存活情況做出較為科學的預測，為監控即食黃瓜的食品安全和風險評估提供參考，為下一步的風險概率分析提供了技術支撐，具體模型見圖1、圖2。

圖1 黃瓜中金黃色葡萄球菌二級模型

圖2 黃瓜中金黃色葡萄球菌一級模型

2.4 污染水平分析

研究表明，食物中金黃色葡萄球菌的濃度大于105CFU·g-1時即可產生致病的腸毒素[27]，引發食物中毒，出現嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉等癥狀。因此，把105CFU·g-1認為導致金黃色葡萄球菌食物中毒的最小濃度。

結合黃瓜中金黃色葡萄球菌的篩查結果、家庭食用黃瓜的膳食調研結果、金黃色葡萄球菌食物中毒診斷標準（105CFU·g-1）以及金黃色葡萄球菌預測模型參數，設置黃瓜中金黃色葡萄球菌QMRA污染水平分析，模型中的參數分布均以@Risk 6軟件的語法設立，具體見表3。經@Risk 6軟件10 000次迭代模擬天津地區黃瓜食用時金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為86.0%在0.00～5.00 log CFU·g-1，超過中毒診斷標準5.00 log CFU·g-1的風險概率為14.0%，具體見圖3。

表3 污染水平QMRA模型

圖3 黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

針對天津地區黃瓜的初始污染水平篩查結果，應用@Risk 6風險評估軟件，筆者發現，貯藏溫度、貯藏時間、最大生長量與污染比例/概率分布的相關系數依次為0.73、0.61、0.03，其中貯藏溫度/概率分布相關性最大，其次為貯藏時間，如圖4所示。

圖4 黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布相關系數

為了降低風險概率，參考最終污染量/概率分布相關系數，控制關鍵變量，如將貯藏時間嚴格控制在24 h食用完畢，經@Risk 6軟件10 000次迭代，模擬天津地區居民食用黃瓜時金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為94.0 %在5.00 log CFU·g-1以下，超過中毒診斷標準5.00 log CFU·g-1的風險概率為6.0%，具體見圖5；如將貯藏溫度嚴格控制在冰箱6℃保存，金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為99.0%在5.00 log CFU·g-1以下，具體見圖6。因此，控制相關性最大的貯藏溫度，可有效地保證天津地區的黃瓜在現有100份居民食用習慣調研數據下的食用安全性。

圖5 黃瓜24 h食用完畢黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

圖6 黃瓜冰箱6℃貯藏方式下金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

3 結論與討論

近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒事件不斷增加，食源性疾病日漸成為威脅人們健康和生命安全的關鍵因素，國內外一些實驗室已對食源性致病菌的定量風險評估進行試驗[28-30]。本研究通過對天津市生產環節、市場環節的黃瓜進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的檢測，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的檢出，檢出比例分別為2/158和1/158，其他2種菌均未檢出，確定天津地區黃瓜中的主要風險因子為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。雖檢出比例不高，但對天津地區即食生鮮果蔬的食品安全來說仍存在一定的風險隱患。

本研究通過對生產環節和市場環節的黃瓜進行食源性致病菌的篩查，并對主要風險因子進行污染水平分析，其試驗數據可為居民食用提供參考。但還缺少對種植、運輸過程中金黃色葡萄球菌的評估，不能對黃瓜“農田到餐桌”的全程進行定量風險評估，在未來的試驗中還需進一步完善。

通過應用@Risk6風險評估軟件，設置黃瓜中金黃色葡萄球菌QMRA污染水平分析，筆者發現，貯藏溫度與最終污染量/概率分布相關性最大，其次為貯藏時間。因此，建議居民最好在購買黃瓜后全部冰箱低溫保存，以降低微生物的生長速度，有效降低居民食用黃瓜感染金黃色葡萄球菌的風險概率；其次，如果不能滿足冰箱保存的條件，建議居民在購買后24 h內食用完畢，以保障居民的食用安全。