順式-異戊烯基轉移酶調控天然橡膠合成的研究進展

謝全亮，朱燁萌，馬子璇，馬璐瑤，楊起航，王厚德，李鴻彬

（石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003）

天然橡膠（NR）是關系民生、醫療、航天和國防等領域的重要戰略物資[1]。2017年，歐盟評估世界27種稀缺原材料中，NR是唯一的生物原料，這充分說明NR在稀缺資源中的重要地位[2]。全球90%以上的NR來源于巴西橡膠樹，巴西橡膠樹是極為重要的橡膠經濟作物。因橡膠樹的原植地破壞、葉枯病侵蝕以及人工采膠耗時耗力等原因，NR產量受到嚴重影響。根據天然橡膠生產國協會報道顯示，2010，2014，2019和2020年全球NR消費量分別為1 000萬、1 200萬、1 155萬和1 259萬t[3]。我國已連續多年為全球NR消費量最高的國家[4]，而我國NR年產量不足年消費量的20%，遠低于國際公認30%的安全產量保障線。我國NR基本依賴于進口，一旦阻斷進口渠道，我國NR產業則難以持續發展。因此，提高NR產量和尋找NR替代經濟作物是我國工農業生產發展和國防安全需求亟待解決的重要問題。

巴西橡膠樹是唯一栽培種植生產NR的樹木[5]。目前，每年因橡膠樹病害和12%～50%的采收割膠死皮發生率，導致NR損失率高達40%左右[6]。

橡膠生物合成機制的精確解析是NR基礎研究中的重要課題。橡膠生物合成的2種主要途徑是甲羥戊酸（MVA）途徑（在細胞質內進行）和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP/DOXP）途徑（在質體內進行），2種途徑都可以合成類異戊二烯橡膠單體IPP（C5H8）[7]。然而，在其他產膠植物中也發現了順式-1，4-聚異戊二烯橡膠（如銀菊橡膠和蒲公英橡膠）和反式-1，4-聚異戊二烯橡膠（如杜仲橡膠）[8-10]。由于反式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子是硬質熱塑性材料，可在低于60 ℃的溫度下快速結晶，更適合作為高爾夫球套和假牙等的材料[11]。

B.L.ARCHER等[12]在1969年首次提出橡膠轉移酶（RTase）是橡膠生物合成的主要合成酶，也是橡膠碳骨架生物合成的關鍵酶。RTase是一種順式-異戊烯基轉移酶（CPT），通過順式構型進行附加IPP縮合，具有確定NR分子鏈長度的專門機制。2013年，巴西橡膠樹基因組草圖被首次報道[13]，揭示了橡膠生物合成不是RTase單一酶作用的結果，奠定了NR生物信息學研究基礎。2016年，C.R.TANG等[14]對橡膠樹基因組進一步測序，獲得1.47 Gb基因組覆蓋率為93.8%的結果。2020年，J.LIU等[15]利用Hi-C技術和單分子實時深度測序，將橡膠樹基因組裝配到18條染色體上，鑒定了許多與產膠相關的候選基因，發現部分基因與橡膠樹栽培品種中的橡膠生物合成有關。

1 聚異戊二烯和NR的生物合成調控機制

聚異戊二烯與NR分子的基本碳骨架結構極為相似，因此二者存在相同的生物合成機制。聚異戊二烯生物合成途徑可分為4階段。第1階段中2種IPP生物合成途徑（MVA和MEP/DOXP途徑）可在植物細胞中提供IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。MVA途徑是由2個乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）分子縮合形成的乙酰乙酰輔酶A（acetoacetyl-CoA）引發，再通過Acetyl-CoA進一步縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA），HMG-CoA在胞質中進一步縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS），而HMGCoA在HMG-CoA還原酶作用下還原形成關鍵的中間分子MVA；隨后MVA被磷酸化和脫羧得到IPP，所得IPP通過IPP異構酶（IDI）轉化為DMAPP。而MEP/DOXP途徑始于丙酮酸和3-磷酸-D-甘油醛的縮合，通過1-脫氧-木糖-5-磷酸合成酶（DXS）形成DXS，通過DXS還原異構酶轉化為關鍵的中間MEP，再以（5～6）∶1的比例形成IPP和DMAPP的混合物[16]。

第2和第3階段是通過異戊二烯鏈延長酶/CPT的作用，IPP與烯丙基二磷酸酯、DMAPP和低聚異戊二烯基二磷酸依次縮合形成線性類異戊二烯。實際上，有反式-異戊二烯基轉移酶（tPT）和CPT 2種類型的轉移酶，其在稠合的異戊二烯單元中新形成的雙鍵的立體化學不同[17]。在第2階段中，全部E-低聚異戊二烯基二磷酸、香葉基二磷酸（GPP，C10）、法呢基二磷酸（FPP，C15）和香葉基香葉基二磷酸（GGPP，C20）都是由1—3種IPP分子通過與特定的tPT結合，再與DMAPP作用最終形成。在第3階段中，將全-E-短鏈異戊二烯基二磷酸酯用作底物，分別通過tPT或CPT構型進行附加IPP縮合。通常RTase嚴格識別烯丙基二磷酸酯底物的異戊二烯鏈長度，并嚴格調節縮合異戊二烯單元中雙鍵產物的鏈長。由于難以確定異戊二烯單元的高相對分子質量聚合物末端基團的精確結構，因此橡膠生物合成途徑中第4階段所涉及的大多數機制仍然未知。

通過對多汁乳菇、向日葵和菊科植物等相對分子質量小的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠進行詳細分子結構分析，發現了分配給伯醇和脂肪酸酯的低信號[18]，隨后證明橡膠樹的相對分子質量大的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子具有與相對分子質量小的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子相似的部分[19]。橡膠樹的蛋白酶處理的NR的酯交換反應表明：NR分子可能將具有飽和或不飽和C10脂肪酸結合到C20鏈上，其中18∶0和18∶1的脂肪酸占主導地位[20]。上述證據與混合（Z，E）型聚異戊二烯的分子結構及其在高等植物中的酯化形式的整合顯示[21]：NR分子的α末端（與異戊二烯單元相反的一端）含有ω末端化合物，具有伯醇或脂肪酸酯的一部分。因此，橡膠生物合成的第4階段中可能是將第3階段中形成超長鏈聚異戊二烯基焦磷酸鹽至少部分去磷酸化并酯化，但是負責NR修飾的酶和確切機制仍然未知。

2 巴西橡膠樹的橡膠生物合成調控機制

橡膠生物合成是將IPP作為合成原料，先經Acetyl-CoA的合成起始階段，接著HMG-CoA經過轉化形成MVA，而MVA轉化成IPP，最后由多個IPP分子通過順式聚合的方式形成高分子聚合物[22]。橡膠粒子（RPs）是橡膠生物合成和貯存的特殊細胞器，RPs膜上有許多種蛋白質共同調控橡膠生物合成[23]，主要通過調控RPs上蛋白質的表達和酶的活性來起作用。在RPs膜上最豐富的蛋白質是IPP、CPT、小橡膠粒子蛋白質（SRPP）和橡膠伸長因子（REF）[24]，其中CPT占比較大，不僅影響橡膠生物合成的速度，還直接關系著膠乳的產量[25]。CPT、SRPP、REF和橋鏈蛋白（HRBP）等的合成與內質網（ER）緊密相關，質膜上的CPT是被SRPP轉入到ER內，而HRBP與CPT結合并相互作用后，再將CPT重新轉至質膜中[26]。雖然這些蛋白質在橡膠生物合成中起著積極和關鍵作用，但NR相對分子質量大小的決定性因素仍不清楚。

橡膠樹割膠后外施乙烯、茉莉酸或者通過多次割膠刺激產膠，從而使流膠時間延長，達到增產的目的。割膠刺激會使CPT，SRPP和REF的信使核糖核酸（RNA）在乳管層和膠乳中的表達量很高[27]。SRPP同源物在乙烯的刺激下參與橡膠生物合成，與REF不同，其只能在產生相對分子質量大的橡膠的植物（如巴西橡膠樹和銀膠菊）中被發現，而不能在產生相對分子質量小的橡膠的植物（如無花果和孟加拉榕）中被發現，這也從側面說明了SRPP在橡膠合成延伸中更為重要。但RPs定量蛋白質組學最新研究表明：RPs膜及結合物幾乎包含橡膠生物合成途徑中所有的蛋白酶和輔助因子以及IPP前體等，RPs上至少含有或者結合有幾百種蛋白質及其復合物。復合物調控并不在基因水平，而在蛋白質，特別是蛋白質翻譯后修飾水平，這些蛋白質包括CPT（RTase）、HMGCoA、SRPP和REF等幾種重要蛋白質或酶的不同異構體，其中REF可能通過其結構域和其他REF或SRPP進行聚合，再通過轉移酶F-ATPase的β-亞基和其它亞基聚合，形成復雜的蛋白質復合物，共同執行橡膠生物合成的相關功能[28]。乙烯刺激橡膠樹增產的機制很可能是RPs上的蛋白質復合物啟動關鍵調控開關，但相關功能研究還需組學分析以及在產膠植物中的進一步轉基因驗證。

3 CPT是橡膠生物合成中的關鍵酶

3.1 CPT可通過多條途徑影響橡膠生物合成過程

CPT又稱為橡膠轉移酶（HRT），是NR生物合成中的關鍵酶[22]，其家族成員可分別與法呢基焦磷酸（FPP）、SRPP、HRBP和REF等互相作用，調控這些關鍵蛋白的活性，從而在橡膠生物合成過程中起到重要的調控作用。橡膠樹RPs蛋白質分離的初步研究發現：經乙烯和機械傷害等刺激后，CPT發生蛋白質翻譯后修飾，從而激活一系列生物學反應，這很可能是RPs膜上的蛋白質復合物啟動關鍵調控開關，使單分子IPP聚合形成長鏈聚合物[29]。在短角蒲公英（TB）RPs上的短角蒲公英順式-1，4-聚異戊二烯轉移酶（TbCPT）蛋白質與SRPP共定位的結果為橡膠生物合成和應激反應之間的聯系提供了進一步證據[30]。

TB膠乳中共鑒定到3個CPT基因，而其他含有順式-1，4-聚異戊二烯橡膠的植物膠乳中有CPT同系物，如蒲公英、萵苣和大戟屬等植物中的CPT已被分離并重組，重組蛋白質在體外沒有顯示出CPT活性[31]，其中的作用機制尚不清楚。但RNA干擾TB乳膠中CPT表達結果顯示[32]：膠乳含量明顯降低，橡膠轉移酶活化子（TbRTA）可結合RPs表面的CPT形成復合體，提高TbRTA活性；RNA干擾抑制TbCPT和TbRTA基因的表達，均可抑制橡膠生物合成過程，這都表明CPT參與了NR的形成。

橡膠樹橡膠轉移酶1（HRT1）、橡膠樹橡膠轉移酶2（HRT2）和橡膠樹橡膠轉移酶1-2（HRT1-2）是CPT的家族成員。據報道[33]，HRT1是來自橡膠樹HbCPT，HRT1和HRT2的重組蛋白質，在體外是不會表現出CPT獨特的活性。在體外并當引入洗滌劑洗脫的橡膠粒子（WRP）時，HRT1才能顯示出明顯的RTase活性，并且HRT1-2主要在膠乳中表達。RTases具有多種組分構成，其中一些是膜的組分，另一些是與WRP膜蛋白質的非共價強烈相互作用相關聯的組分，經預測可能是橡膠生物合成蛋白質對應的底物以及活化劑的復雜性阻止了RTases復合物的完全重構，從而抑制了RTases的活性[34]。WRP蛋白質組學和蛋白質相互作用網絡分析揭示了HRT1，REF以及HRT1-REF連接蛋白質組成了蛋白質復合物，從WRP上組裝的該蛋白質復合物觀察到RTases的活性增強，表明含有HRT1的復合物為橡膠生物合成機制起到重要的調控作用。

3.2 CPT是NR生物合成中的關鍵酶

RTases是唯一能夠形成CPT家族的獨特亞組，RTases對IPP底物具有較強的親和力，可防止橡膠生物合成過程中IPP的短缺，只有在IPP超過細胞代謝需求時才能產生長分子鏈聚合物[35]。在非產膠植物中，CPT與RTase易被混淆，除去RPs上35 kDa的CPT后，RTase的活性并不會產生影響。因此，CPT可以影響橡膠生物合成，而不影響RTase的活性。CPT還參與甾醇合成，從而形成細胞膜（可能包括RPs膜）。此外，大多數長分子鏈CPT的直接產物是相對短分子鏈的順式-烯丙基焦磷酸鹽，其可作為橡膠生物合成的引發劑。

不同類型CPT蛋白質的定位是不同的，具有不同的底物結合位點，從而產生不同的聚合產物，CPT家族成員具體定位及功能必須解析清楚，這是研究CPT在NR生物合成中具體作用的前提。

自20世紀80年代R.THOMAS提出基因組學概念后，以基因組學為核心的轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學、等組學相繼展開。生物信息學與多組學技術結合已經成為生命科學、醫學以及系統生物學研究的重要研究手段。產膠經濟作物巴西橡膠樹[36]和蒲公英屬已相繼開展了組學研究。在轉錄組研究方面，F.PANARA等[37]在低含膠量（LR）和高含膠量（HR）的俄羅斯蒲公英（TKS）中進行轉錄組比較顯示，LR TKS和HR TKS參與順式-1，4-聚異戊二烯生物合成的基因高度表達，并證明了倍半萜類化合物、苯丙烷類以及次級代謝單萜類化合物生物合成的基因在LR TKS中上調。用茉莉酸甲酯（JA）處理TKS幼苗根后進行轉錄組差異表達分析[38-39]，羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）、法呢基焦磷酸合酶（FPPS），IDI，GGPP和REF/SRPP的表達增加，但這些關鍵基因在轉基因功能驗證方面并未進一步闡明。JA可以調節TKS根中的次生代謝途徑，參與橡膠生物合成的幾種候選基因的表達增加，JA響應的轉錄因子與基因間相互作用，這些基因蛋白質組學層面的研究現在還不深入。Z.LUO等[40]基于LR TKS和HR TKS根轉錄組相關的單核苷酸多態性（SNP），確定了合適的脫氧核糖核酸（DNA）標記，可以在TKS生長發育早期確定橡膠產量。轉錄組學雖然在TKS研究中逐漸展開并取得了突破性進展，但單組學研究不能夠全面解析TKS橡膠生物合成調控機制，還需利用多組學及轉基因等手段深入研究橡膠生物合成的機制。

在蛋白質組研究方面，2012年D.WAHLER等[41]通過雙向電泳（2-DE）分離TB的膠乳全蛋白，首次報道TB膠乳的凝膠圖譜，共鑒定了278個獨特的蛋白質點。結果顯示，TB膠乳蛋白質中參與脂質代謝和運輸的蛋白質較多，而參與應激反應的蛋白質相對較少。2019年，Q.L.XIE等[42]對TKS成熟根全蛋白質的研究顯示：由2-DE和鳥槍法（shotgun）分別鑒定231和3 545種蛋白質發現，TKS的CPT基因啟動子具有乙烯響應元件，這也是乙烯能促進TKS產膠的根本依據。結合蛋白質組學的2種方法分析TKS成熟根的全蛋白質得出：橡膠生物合成的2種途徑中所包含的所有蛋白質幾乎得到鑒定，但每種蛋白質的家族成員鑒定還不夠全面，有些蛋白質在TKS成熟期時并未表達，還需要進一步通過外界刺激讓其表達產生作用。

4 利用TKS研究橡膠生物合成的必要性

TKS是菊科，主要分布于我國新疆、哈薩克斯坦及歐洲。其根部含有大量以順式-1，4-聚異戊二烯為主的橡膠，其橡膠的分子結構和性能與NR極為相似，由于生育期短、組織培養簡單、遺傳轉化容易，已成為研究產膠機理的模式植物[43]，同時由于其適應性強、分布范圍廣、機械化采收便利等，被認為是最有商業化前景的NR替代資源植物。但TKS在很大程度上未被馴化，存在一些固有問題，尤其是其橡膠生物合成能力未達到規模化種植要求，制約了產業發展。解析TKS橡膠生物合成機理是快速提高TKS橡膠產量的重要途徑之一。前期蛋白組學研究發現，TKS的MVA和MEP途徑中所有蛋白質都參與橡膠合成，TKS基因組中鑒定了8種CPT和2種編碼RPs蛋白質基因CPTL，并且其家族成員CPTL1在乳膠中高度表達，這些家族成員為后續CPT基因的具體功能研究提供了更多靶標基因[42]，但調控橡膠生物合成的關鍵基因/蛋白質還未精確解析。深入研究TKS中CPT在橡膠合成調控復合物的組成及不同組成部件的具體生物學功能，很可能為揭示橡膠生物合成和調控的精準機制提供新的研究思路。

5 TKS是補充或替代NR的新型產膠植物

TKS是二倍體多年生草本植物，根部橡膠質量分數可達約0.24，其產膠周期短、生長適應性強、具有較高成活率和大規模栽培的能力[43-44]。然而，TKS具有與其他蒲公英屬高雜合性、自交不親和性以及橡膠含量未達到商業上規模化種植要求等特性[45]。TKS高雜合性對于產生完整的基因組序列和以其作為產膠經濟作物提出了嚴峻的挑戰。

從TKS中已克隆了控制橡膠生物鏈延長及合成的基因，并且對其功能進行了初步分析[46-48]，但研究僅局限于其橡膠生物合成的代謝途徑等方面。

基于TKS基因組的公布[48]，轉錄組學和蛋白質組學方面的研究[49]也不斷深入。利用TKS基因組深入分析數據，發現一些與自交衰退相關的可能候選區域，證實了TKS自交不親和性的遺傳物質基礎。TKS基因組成功解析大大降低了克隆橡膠生物合成的關鍵基因的難度，加速推進基于基因組信息的TKS農藝性狀關聯分析，從而提升通過轉基因技術和基因編輯技術提高TKS分子育種的能力，也加速TKS中橡膠生物合成的分子機制研究和遺傳改良優質品種的進程。

6 結語

目前橡膠生物合成和調控很可能主要是在RPs膜上進行的，通過促進RPs膜上蛋白質復合物中重要蛋白質的磷酸化、泛素化和糖基化等翻譯后修飾來精準調控橡膠的生物合成。然而，調控CPT家族關鍵成員與上下游相關蛋白質以及橡膠生物合成的具體調控機制還不清楚。未來應主要開展產膠植物CPT的關鍵家族成員的研究，以及利用植物激素等刺激產膠植物尋找CPT在橡膠生物合成中的規律。通過基因組學、轉錄組學和蛋白質組學相結合，找到橡膠生物合成的關鍵RNA和蛋白質，確定蛋白質翻譯后修飾調控方式，挖掘和篩選橡膠生物合成的關鍵基因/蛋白質，同時結合基因編輯和轉基因技術，精確解析橡膠生物合成的關鍵代謝途徑和關鍵基因/蛋白質，獲得較為重要的原創性發現，為今后優質TKS的分子育種提供理論依據和基因資源，以及為NR產業多元化升級提供技術支持和理論依據。