宏基因組二代測序在兒童感染性疾病中應用的研究進展

劉穎梅，雷亞茹，石 瑜，張 莉，李占魁

(1.西安醫學院，陜西 西安 710000；2.西北婦女兒童醫院新生兒科，陜西 西安 710061)

感染性疾病是兒童發病率較高的疾病。兒童作為特殊群體，各器官功能發育不完善，免疫功能低下，易受各種病原體侵襲，是醫院感染高危人群，重癥感染患兒易并發休克、臟器功能衰竭而威脅生命。因此，盡早明確病原菌感染、針對性給予抗感染治療，對于減少患兒并發癥、降低病死率及改善預后有重要意義。

兒童感染性疾病的臨床病原學診斷受采樣困難、檢測方法復雜等各種因素影響。以敗血癥為例，目前診斷的金標準仍依賴于血培養，但其有耗時長、靈敏度低、陽性率低等特點，難以滿足當今兒科感染性疾病的診療需求。同時，對于不明原因發熱的患兒，更需要快速、精準的檢測方法鑒定出病原體。此外，常規檢測方法易受抗生素的影響而造成假陰性，即便存在感染也未必全部能分離出病原微生物[1]。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術具有無需培養，可直接對臨床樣本核酸進行測序的特點，從而快速、精準地檢測出病原體，避免了傳統病原體檢測方法的局限性[2]。目前該技術逐漸應用于臨床各科室，尤其是對危重疑難感染性疾病的診治[3-5]。現對宏基因組二代測序在感染性疾病中應用的研究進展進行綜述，為兒童感染性疾病的臨床精準診治提供參考依據。

1宏基因組的簡介

宏基因組學亦稱為“元基因組”，它是一種誕生于21世紀初期的新興微生物檢測技術，其定義是“微生物群落中所有基因組的集合”[6]。宏基因組學研究較傳統的微生物研究而言，其最大的特點在于將微生物看成一個整體，直接對環境中所有微生物的遺傳信息進行全面分析研究，而非依賴于對單個微生物進行培養和分離，以此來提高時效性。近年來，隨著測序技術及信息化時代的飛速發展，將宏基因組學技術研究又推向了新的高潮。

2 mNGS技術的發展史

研究者Sanger提出的酶法測序[7-8]及Maxam和Gilbert等提出的化學降解法測序[9]標志著DNA測序時代的來臨。以Sanger法為代表的一代測序技術可一次性對1條DNA分子進行測序，最長能測到1 000～1 500bp，對生物學研究具有重大意義。但因該技術成本高、速度慢等局限性，并不是最佳的測序方法。隨著有關技術的不斷研發，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Soiexa技術和ABI公司的SOLID技術標志著第二代測序技術的誕生[8]。

mNGS是繼Sanger測序后的一項新興技術。mNGS是一種無偏差的檢測病原體的方法，可一次性對幾百萬條到十億條DNA分子進行并行測序，因此又稱高通量測序。mNGS可分析自然界中99%尚未培養的微生物，直接對樣本中的DNA或RNA進行高通量測序，能夠快速、客觀的一次性檢測出樣本中的多種病原微生物，為急危重癥和疑難感染性疾病提供了診斷依據[10-11]。可見mNGS在提高病原體鑒定方面具有很大潛力。

宏基因組二代測序病原體檢測包括樣本采集、核酸提取、文庫構建、高通量測序、生物信息分析和生成報告，檢測全流程24～72h即可完成交付。Wilson等[12]2014年在《新英格蘭醫學雜志》發表了人類醫學史首個利用mNGS在1名先天性免疫缺陷的14歲兒童腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)標本中找到鉤端螺旋體特異序列，從此拉開了mNGS在臨床應用的帷幕。

3 mNGS在兒童感染性疾病診斷中的應用

3.1 mNGS血漿游離DNA測序檢測在兒童膿毒血癥中的應用

膿毒血癥是一種威脅兒童生命的感染性疾病，早期診斷并及早給予抗菌藥物治療是挽救生命的關鍵，而快速的病原學診斷可以幫助臨床醫生合理的使用抗菌藥物。雖然聚合酶鏈式反應(PCR)技術在臨床應用越來越成熟，但該方法僅局限于病毒及部分特定細菌的檢測。2016年，Grumaz等[13]建立了一套完整的診斷工作流程，該流程基于mNGS血漿游離DNA(mcfDNA)進行無偏差序列分析，可以鑒定傳統培養方法所遺漏的潛在細菌病原體，進而識別感染微生物。Abril等[14]報道了首次利用mNGS在重癥膿毒血癥患者的血漿中檢測出了犬鏈球菌，并通過16SrRNA測序和血培養再次證實了是由犬鏈球菌引起的膿毒癥感染性休克和多器官衰竭的病例。Long等[15]研究利用mNGS法和血培養對78例重癥監護病房(ICU)中的患者血液進行分析，并通過PCR擴增/Sanger測序驗證，結果顯示mNGS的靈敏度優于血培養(30.77% vs.12.87%)，此外，mNGS還從14個標本中檢測到15種病毒，而傳統培養未檢出，該研究表明mNGS在細菌、病毒檢測方面更具優勢，可有效地識別多種病原體感染。Goggin等[16]在一項研究中評估了游離DNA測序(mcfDNA-seq)技術檢測血液系統腫瘤患者血漿中病原菌的敏感性和特異性，指出mcfDNA-seq可以預測75%復發性癌癥患兒中血行感染(bloodstream infaction，BSI)的病原菌，特異性超過80%，首次驗證了基于mNGS的mcfDNA在BSI發生前識別病原體的新假設，使預防性治療成為可能。Timsit等[17]已經將mcfDNA的mNGS檢測作為新的BSI早期診斷方法納入專家共識，肯定了血漿mcfDNA的mNGS檢測在臨床病原微生物鑒定的良好前景[18]。

3.2 mNGS在兒童下呼吸道感染性疾病中的應用

呼吸道感染性疾病嚴重威脅兒童健康，造成了重大的社會經濟負擔。因此，病原體的早期識別和鑒定對于精準治療至關重要。Wang等[19]對32例重癥肺炎患兒的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)樣本，使用傳統檢測方法和mNGS進一步鑒定病原體，結果發現在全部32例BALF中，mNGS鑒定出包括腺病毒、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、巨細胞病毒和博卡病毒等；而在15例BALF樣本中，傳統檢測法未發現常見病原體，表明mNGS可以提高患兒重癥肺炎病原體檢測的敏感性。Lin等[20]報道了1例經血漿mNGS診斷患兒嗜麥芽窄食單胞菌重癥肺炎的案例，該患兒入院后行常規檢查均為陰性，考慮患兒年齡小、病情重，不適合采集BALF樣本，對其血液進行了mNGS檢測，結果發現嗜麥芽窄食單胞菌為血液唯一細菌病原體，此外還發現幾種真菌。mNGS在新型冠狀病毒(COVID-19)肺炎疫情診斷中也發揮了重要作用。Ren等[21]利用mNGS技術，在5名重癥肺炎患者的BALF中鑒定出了以前未知的冠狀病毒，并通過Sanger測序確認了其基因組序列，最終證實COVID-19起源于蝙蝠。隨后，Wu等[22]利用mNGS對死于COVID-19患者的肺和結腸轉錄組及蛋白組進行了分析，并對患者肺中嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)的宿主反應進行了詳細評估，發現患者的死亡可能與宿主反應有關，而不是病毒感染爆發引起的，揭示了COVID-19的病理生理學，并為重癥COVID-19疾病提供了潛在的治療靶標。因此，對于不明原因的下呼吸道感染，mNGS將提高對兒科“未知”病原體的診斷率，可協助對新型病原體的鑒定。

3.3 mNGS在兒童中樞神經系統感染診斷中的應用

中樞神經系統感染性疾病是一種威脅兒童生命的常見神經科疾病，早期診斷困難，一旦發展到重癥腦膜炎預后較差，可引起嚴重的并發癥和后遺癥。因此，及時準確的診斷方法和積極的抗生素治療對改善其預后至關重要。Zhang等[23]在一項回顧性研究中首次分析了mNGS對腦膜炎患兒感染肺炎鏈球菌的診斷價值，在135例患者CSF標本中經mNGS鑒定出肺炎鏈球菌32例，利用臨床微生物檢測法(培養法或肺炎鏈球菌抗原檢測法)和PCR進行驗證，結果顯示在病例26中通過培養法檢測到肺炎鏈球菌，而PCR檢測結果為陰性；在病例28中通過培養法檢測到金黃色葡萄球菌，而PCR并未檢測出病原菌，表明mNGS的靈敏度高于PCR。2020年潘春熹等研究表明，在使用抗生素后mNGS對病原體檢測較傳統方法有較高的靈敏度。Wang等[24]報道了1例用mNGS在患兒CSF樣本中鑒定出罕見的解脲脲原體的病例，并通過PCR進一步證實，患兒得到迅速及時診斷，紅霉素治療4周后治愈，臨床隨訪未見后遺癥。因此，mNGS在中樞神經系統感染診斷中的應用具有重要價值。

4 mNGS應用于感染性疾病中存在的問題

4.1定植和感染的區分

對于呼吸道感染，mNGS在病毒及罕見病原體中具有較好的檢測效能，但在細菌、真菌的檢測中，尚不能準確判斷菌群定植或感染狀態，需要結合臨床具體分析。近年來，臨床微生物學實驗室已開發出可將真正病原菌與培養皿中的定居者分開的程序，并且正在為mNGS開發類似方法[25]。另一種方法是監測和評估宿主的免疫反應[26]。這些方法可能需要進一步研究，以確定區分定植和感染的最佳方法。

4.2有關數據的儲存和分析及數據庫

mNGS在疾病診斷中的主要難題是能夠將數據轉化為與臨床相關的信息。在儲存和分析方面，mNGS生成的大量數據繁重，其中包括對主機的讀取，可能涉及到患者的隱私問題。此外，需要快速的生物信息學工具進行數據分析，以獲得可用于臨床的結果。目前，臨床實驗室需要人工智能來補充生物學信息專業知識，有研究者建議使用K-聚物、標記和對比進一步對數據進行分析，以確保最高靈敏度和特異性[27]。最后，由于數據庫中部分序列包含錯誤信息，可能導致假陽性結果，因此需不斷更新數據。

4.3 mNGS報告的正確解讀

對于臨床醫生而言，最大的挑戰也許是對mNGS結果的解釋，當前尚無統一標準，不能單純只看檢測值，還應結合參考值及感染灶進行綜合分析，否則容易誤判。為解決這個問題，一些機構建立了由醫學微生物學、生物信息學、傳染病專家及其它臨床小組組成的醫學團隊，其可在出報告前進行討論，并提供對mNGS結果的解讀，這樣可確保解讀的報告與臨床數據是相關的。

5展望

綜上所述，mNGS作為一種新興的病原微生物診斷技術，尚不能完全代替傳統的診斷方法，但對于常規方法無法診斷的重癥感染患兒，可作為一種補充手段來識別病原體。目前，mNGS技術在成人的應用中已經得到了專家的肯定，并被納入了“宏基因組學測序技術在中重癥感染中的臨床應用專家共識(第1版)(李穎等2020年)”“中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識”及有關文獻[17]，期待更多的臨床研究來推廣mNGS在兒童重癥感染性疾病中的應用。