血漿miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1表達水平與2型糖尿病視網膜病變的關系

王艷新，賈冠美,曹 朗,曹順義,張士宏

(河北省保定市第二中心醫院眼科，河北 保定 072750)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)常見的一類眼部并發癥和微血管病變，是導致參加工作的成年人發生嚴重的永久性視力障礙甚至失明的主要原因[1-2]。目前，對于重度DP患者的視力恢復尚無有效干預措施，早期診斷有利于預防或延緩視力喪失。微小RNA(microRNA，miRNA)是血管發育的關鍵調節因子，研究表明與病理性視網膜病變有關[3]。miR-let-7e-5p作為家族成員之一，參與調控多種疾病的發展過程，大量研究報道miR-let-7家族成員在視網膜病變中發揮關鍵作用[4-5]。長鏈非編碼(long non-coding RNA，LncRNA)是一大類異質的功能性RNA，許多lncRNA在DR中表達上調，參與DR的發展[6]。研究發現lncRNA核富含豐富的轉錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)在DR中具有調節作用[7]。目前為止，尚未見關于miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1與DR關系的臨床研究，由于血液樣本易獲取，因此本研究以血漿作為檢測樣本，通過檢測T2DM患者血漿miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1的表達水平，以探討兩者與DR的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月—2021年6月我院收治的T2DM患者126例納入研究。納入標準：年齡≥18歲，根據《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[8]中的診斷標準確診為T2DM，排除以下情況的患者：①合并惡性腫瘤；②合并肝腎功能不全；③合并心腦血管疾病和神經系統疾病；④全身感染或自身免疫性疾病；⑤沒有光感(嚴重視力障礙)或眼睛有嚴重感染；⑥孕婦。基于散瞳眼底檢查結果，根據有無DR情況將126例T2DM患者分為84例DR組和42例非DR組，參照《糖尿病視網膜病變防治專家共識》[9]中診斷標準，DR組包括男性44例，女性40例，年齡(59.82±12.05)歲；非DR組包括男性24例，女性18例，年齡(57.95±12.70)歲；根據DR分級標準[9]劃分為31例非增生型DR(non-proliferative DR，NPDR)和53例增生型DR(proliferative DR，PDR)。

所有參與者均簽署了書面知情同意書，且經本院倫理委員會審核、批準后實施。

1.2數據收集 臨床數據來自醫療記錄，包括年齡、性別、體重指數(body mass index，BMI)、糖尿病病程、收縮壓和舒張壓、空腹血糖、高血壓病史、吸煙史、飲酒史、血脂、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)水平。

1.3血漿miR-let-7e-5p、lncRNA NEAT1表達水平的檢測 所有研究對象在入院第1天采集5 mL空腹血樣，離心后，血漿樣品立即儲存在-80 ℃直至測定。使用總RNA提取試劑(Total RNA Extraction Reagent，TRIzol)試劑(貨號：15596026，賽默飛世爾科技有限公司)進行血漿總RNA提取，然后將所有樣品儲存在2 mL無酶離心管中，使用Nanodrop分光光度計(型號：NanoDrop 2000，賽默飛世爾科技有限公司)來測定RNA的濃度和質量。取1 μg RNA按照Prime Script RT反轉錄試劑盒(貨號：RR036A，北京寶日醫生物技術有限公司)中說明書的方法合成互補DNA(complementary DNA，cDNA)，通過實時熒光定量(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)對血漿miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1的表達水平進行量化，qRT-PCR引物序列見表1，分別以U6和三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參基因。按照SYBR Green Master Mix(貨號：RR420L，北京寶日醫生物技術有限公司)說明書的方法混合20 μL反應體系，使用ABI7500熒光定量系統(美國應用生物系統公司)進行以下程序：95℃初始變性30 s，40個循環，95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s。每個反應重復進行，根據2-△△CT方法計算miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計量資料采用t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗；計數資料采用χ2檢驗；通過Pearson相關系數對miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1表達水平進行相關性分析；通過受試者工作特征(receiver operator characteristic curves，ROC)曲線檢測miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1對DR的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組臨床資料比較 DR組和非DR組的年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、高血壓病史、吸煙史、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平、飲酒史差異無統計學意義(P>0.05)；DR組的糖尿病病程、HbA1c水平顯著高于非DR組(P<0.05)，見表2。

表2 2組臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data between two groups

2.2不同組中血漿miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1的表達水平 與非DR患者相比，PDR和NPDR患者的血漿miR-let-7e-5p表達水平降低，LncRNA NEAT1表達水平增加(P<0.05)；并且與NPDR組相比，PDR組的血漿miR-let-7e-5p表達水平降低，LncRNA NEAT1表達水平升高(P<0.05)，見表3。

表3 不同組血漿miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1的表達水平比較Table 3 Comparison of plasma miR-let-7e-5p and LncRNA NEAT1 expression levels in different groups

2.3DR患者血漿miR-let-7e-5p與LncRNA NEAT1表達水平相關性分析 Pearson相關性分析顯示，DR患者血漿miR-let-7e-5p與LncRNA NEAT1呈負相關(r=-0.534，P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-let-7e-5p與LncRNA NEAT1表達水平相關性分析

2.4ROC曲線評估miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1診斷DR的價值 ROC曲線結果顯示，單獨miR-let-7e-5p診斷DR的AUC為0.856(95%CI：0.789～0.924)，最佳截斷值是0.83，相應的敏感度為77.38%，特異度為80.95%，準確度為78.57%；單獨LncRNA NEAT1診斷DR的AUC為0.844(95%CI：0.778～0.910)，最佳截斷值是1.42，相應的敏感度為69.05%，特異度為95.24%，準確度為77.78%；兩者聯合診斷DR的AUC為0.935(95%CI：0.891～0.978)，敏感度為88.10%，特異度為92.86%，準確度為89.68%。兩者聯合對DR患者具有較高的診斷能力，見圖2，表4。

圖2 miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1診斷DR的ROC曲線

表4 miR-let-7e-5p、LncRNA NEAT1診斷DR的價值Table 4 Value of miR-let-7e-5p and lncRNA NEAT1 in the diagnosis of DR

3 討 論

隨著發達國家和發展中國家DM全球發病率的增加，DR的患病率也同樣增加，DR仍然是視力受損的最常見原因，大約三分之一的DM患者發展為DR，不僅影響T2DM患者的生活質量，同時給家庭和社會造成巨大的經濟負擔[10]。臨床實踐中廣泛應用的生物標志物很少，挖掘準確識別DR的生物標志物有利于制定高危人群早期預防和針對性管理的策略。

許多研究已經認識到，炎癥在DR的發病機制和進展中起重要作用[11]。在過去的十年中，miRNAs作為糖尿病微血管并發癥的潛在參與者受到了大量的關注，異常表達的miRNAs在微血管并發癥的關鍵致病過程中發揮了關鍵作用，如氧化應激、凋亡、炎癥和血管生成，越來越多的證據表明，特定miRNA的表達模式和水平可以揭示T2DM患者微血管和大血管并發癥的生理和病理狀況改變，并且被廣泛認為是一種有吸引力的新型生物標志物[12]。miR-let-7e-5p是miR-let-7e家族的成員之一，閆智永等[13]研究表明miR-let-7e-5p抑制變應性鼻炎的發生和發展，過表達后抑制炎性細胞的浸潤，顯著減輕炎癥反應。另一方面miR-let-7e-5p被證明參與內皮細胞的血管生成，其表達下調可導致深層內皮祖細胞功能障礙[14]。在本研究中，分析了T2DM患者miR-let-7e-5p與DR的關系，首先，通過qRT-PCR反應發現了miR-let-7e-5p在PDR和NPDR患者中的表達趨勢，PDR和NPDR患者的血漿miR-let-7e-5p表達水平顯著降低，而PDR患者miR-let-7e-5p表達水平低于NPDR，表明miR-let-7e-5p在DR的發生和進展中發揮作用，并且可能與DR的病情有關。miR-let-7e-5p診斷DR的AUC為0.856(95%CI：0.789～0.924)，敏感度為77.38%，特異度為80.95%，對于T2DM患者DR的發生具有一定的診斷價值，血漿miR-let-7e-5p水平降低可能是T2DM患者DR發生的診斷標志物。

研究文獻表明，LncRNAs在參與DR進展的炎癥通路中發揮關鍵的調節作用[15]。一些研究表明，Lnc NEAT1在T2DM的發病機制和發展中異常表達，此外Lnc NEAT1通過影響炎癥通路具有促炎作用。根據Shao等[16]報道，DR患者血清NEAT1水平明顯升高，LncRNA NEAT1下調通過抑制轉化生長因子β1和血管內皮生長因子信號通路來改善高糖誘發的凋亡、氧化應激和炎癥，從而對DR的發生和發展發揮抑制作用。根據ROC曲線分析表明上調的lncRNA對于DR具有潛在的診斷價值，可能是DR的新型診斷生物標志物。在本研究中，LncRNA NEAT1在PDR和NPDR患者的血漿中的表達水平增加，提示LncRNA NEAT1可能參與了T2DM患者的DR的發病機制。PDR患者中顯著高于NPDR患者，表明LncRNA NEAT1表達水平可能隨著DR的嚴重程度加重而增加。本研究采用ROC曲線評估了血漿LncRNA NEAT1作為一種新型分子生物標志物對DR的診斷價值，LncRNA NEAT1診斷DR的AUC為0.844(95%CI：0.778～0.910)，敏感度為69.05%，特異度為95.24%，ROC曲線表明血漿LncRNA NEAT1水平在區分DR和非DR受試者方面具有一定的價值。在分析將血漿miR-let-7e-5p水平和LncRNA NEAT1水平診斷DR的合理性時，結果表明單一指標對DR診斷的敏感度較低，而通過聯合檢測發現診斷DR的AUC和敏感度有所提高，擁有更佳的診斷效率。

lncRNA可以充當miRNA海綿來調節蛋白質編碼基因的表達，以往研究發現敲除LncRNA NEAT1會激活miR-let-7e，miR-let-7e通過減少遷移、侵襲和增殖，從而起到癌癥抑制劑的作用。LncRNA NEAT1與miR-let-7e-5p之間的作用尚不清楚，本研究分析了DR患者血漿中LncRNA NEAT1與miR-let-7e-5p表達水平的相關性，NEAT1和miR-let-7e-5p存在負相關關系，初步認為LncRNA NEAT1與miR-let-7e-5p在DR的發生和發展中相互作用，具體關系仍需進行下一步研究證實。

綜上所述，miR-let-7e-5p和LncRNA NEAT1可能作為一種潛在的生物標志物與T2DM患者DR的發生和進展有關，檢測血漿miR-let-7e-5p和LncRNA NEAT1表達水平有助于診斷DR的發生，且兩者聯合的診斷能力更佳。