血清外泌體Glypican-1在乳腺癌中的表達水平及臨床應用價值

郭奕陽，馬偉麗，曹詩茹，郭秀娟，鄧艷麗，張金艷*

(1.河北醫科大學第四醫院檢驗科，河北 石家莊 050011；2.河北省胸科醫院分子生物學實驗室，河北 石家莊 050011；3.河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所，河北 石家莊 050011)

全球范圍內，乳腺癌的醫療負擔都在增加，位居中國女性癌癥發病率第一位[1]。依靠敏感度高、特異度強的生物標志物可以提高早期診斷率，同時實施安全有效的精準治療可以提高存活率[2-3]。但是，現階段仍然缺乏乳腺癌早期診斷的生物標志物[4]。外泌體是一種廣泛存在于體液，如血漿、尿液、唾液中的分泌小囊泡[5]。乳腺癌細胞分泌的外泌體在細胞增殖、細胞轉移、血管生成和免疫應答等方面發揮調節作用[6]。通過分析乳腺癌細胞系MDA-MB-231和非癌性乳腺細胞系MCF-10A的外泌體蛋白質組差別，發現血清外泌體膜蛋白Glypican-1有作為乳腺癌早期診斷標志物的潛在價值[7]。本實驗采用臨床樣本對血清外泌體膜蛋白Glypican-1進行進一步的檢測與研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年4—7月因新發乳腺腫塊于河北醫科大學第四醫院就診的患者66例，均由病理組織學檢查確診，其中乳腺良性占位18例，乳腺癌48例，所有患者之前均未經任何治療。另收集與其相匹配的同時期于河北醫科大學第四醫院體檢的健康查體者17名，為健康對照組。

本研究經醫院倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2血清外泌體提取及鑒定

1.2.1制備血清 所有研究對象均于空腹狀態下采集4 mL外周靜脈血，待自然凝固后，離心取血清，-80 ℃保存備用。

1.2.2血清外泌體提取及鑒定 采用聚乙二醇沉淀法提取血清外泌體，取0.5 mL待檢血清，加入120 μLPEG 8 000工作液，充分混勻，4 ℃靜置30 min，1 500 g離心30 min，棄上清，再次1 500 g 離心5 min，吸出殘液，所得沉淀即所需外泌體，經透射電子顯微鏡觀察外泌體形態和Western blot檢測外泌體表面蛋白標記物CD9后，-80 ℃凍存。

1.3血清外泌體GPC-1的檢測 采用Western blot檢測乳腺癌組、乳腺良性占位組和健康對照組血清外泌體GPC-1的表達水平，及乳腺癌組治療前后血清外泌體GPC-1表達水平。

1.4臨床數據整理 收集乳腺良性占位組和乳腺癌組血清腫瘤標志物、乳腺超聲、鉬靶和病理組化結果，并進行整理總結。

1.5統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據，非正態分布計量資料采用Kruskal-Wallis H檢驗、Wilcoxon秩和檢驗，正態分布的計量資料采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線評價血清外泌體GPC-1對乳腺癌的診斷價值。以病理診斷為金標準，計算血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標志物、超聲、鉬靶射線四種診斷方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值，采用Kappa一致性檢驗評價四種診斷方法對乳腺癌的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1血清外泌體形態及分子鑒定 使用PEG8000 沉淀法提取血清外泌體，透射電鏡下觀察外泌體呈杯托樣，直徑約為100 nm(圖1)。Western blot檢測血清外泌體標記蛋白，可見CD9的表達條帶(圖2)。結果證明所提取的沉淀物為外泌體。

圖1 血清外泌體形態

圖2 血清外泌體CD9表達

2.2三組標本間血清外泌體GPC-1的表達水平差異 Western blot檢測乳腺癌組、乳腺良性占位組和健康對照組血清外泌體GPC-1表達水平，55kDa左右可見明顯條帶(圖3)，對蛋白條帶灰度分析后可得，三組間血清外泌體GPC-1表達水平不全相同，乳腺癌組血清外泌體GPC-1表達水平[1.065(0.501)]高于乳腺良性占位組[0.652(0.711)]和健康對照組[0.625(0.117)]，差異有統計學意義(H=32.051，P<0.05)。

圖3 血清外泌體GPC-1表達

2.3血清外泌體GPC-1對乳腺癌的診斷價值 以病理檢查結果為金標準，利用ROC曲線評估血清外泌體GPC-1檢測結果對乳腺癌的診斷價值。結果顯示，ROC曲線下面積(AUC)為0.900(95%CI:0.833～0.967)，最佳截斷值為0.961，即血清外泌體GPC-1值≥0.961時診斷為乳腺癌，此時診斷的敏感度為72.9%，特異度為97.1%(圖4)。

圖4 血清外泌體GPC-1診斷乳腺癌的ROC曲線

2.4乳腺癌組血清外泌體GPC-1在不同臨床及病理特征組的比較 根據乳腺癌組血清外泌體GPC-1表達水平，以最佳截斷值為0.961為界，將48例乳腺癌患者分為GPC-1陽性組和GPC-1陰性組，分析其表達水平和患者臨床特征的關系。結果顯示GPC-1陽性在不同TNM分期組、淋巴結浸潤組和Ki-67高表達組間差異有統計學意義(P均<0.05),在不同患者年齡、月經、遠端轉移和HER-2表達組間差異無統計學意義(P均>0.05),見表1。

表1 血清外泌體GPC-1表達水平在不同臨床及病理特征的組間的比較Table 1 Comparison of expression level of serum exosomal GPC-1 in different clinical pathological characters groups (例數，%)

2.5乳腺癌組治療前后血清外泌體GPC-1的表達水平差異 Western blot檢測乳腺癌組治療20 d前后的GPC-1表達水平，經蛋白條帶灰度分析后可得，治療前血清外泌體GPC-1表達水平[1.065(0.501)]高于治療后血清外泌體GPC-1表達水平[0.844(0.195)]，差異有統計學意義(Z=856.000，P=0.006)。

2.6血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標志物、乳腺超聲、鉬靶四種檢測方法對乳腺癌診斷價值的分析 以病理檢查結果為金標準，分別用血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標志物、乳腺超聲、鉬靶診斷乳腺良性占位組和乳腺癌組共66例患者，四種檢測方法的診斷結果見，見表2。并分別對四種檢測方法與金標準病理檢查結果做Kappa一致性檢驗，血清外泌體GPC-1檢測方法的Kappa值為0.485>0.4，與病理檢查比較一致性中等，且優于其他3種檢測方法，見表3。

表2 乳腺癌四種檢測方法的診斷結果Table 2 The results of four detection methods in the diagnosis of breast cancer (例數)

表3 乳腺癌四種檢測方法的一致性檢驗Table 3 Consistency test of the four detection methods for breast cancer

3 討 論

Glypicans是硫酸類肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)家族一員，通過C末端的糖基磷脂酰肌醇連接到細胞膜外膜[8],GPCs家族通常分為六種(GPC-1～GPC-6)[9]。GPC-1在胰腺癌[10]，膠質瘤[11]，食管癌[12]等多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤細胞的增殖、轉移和血管生成密切相關[12-13]。外泌體由體內多種細胞分泌而來，可進入外周血循環[14]。外泌體檢測具備標本易采集、穩定，能夠實時動態檢測和反映分泌細胞生物學特性等優勢[15]。有研究通過免疫組化法對220例乳腺癌患者GPC-1表達水平進行檢測，發現乳腺癌組織中GPC-1高表達與正常組織比較差異有統計學意義，且在乳腺癌晚期和大直徑腫瘤的患者中，GPC-1表達顯著升高[16]。本研究通過檢測乳腺癌組、乳腺良性占位組和健康對照組血清外泌體GPC-1表達水平，發現乳腺癌組血清外泌體GPC-1水平高于乳腺良性占位組和健康對照組，與以往檢測乳腺組織的實驗結果保持一致，證明血清外泌體中的GPC-1可以準確的反應乳腺組織細胞的變化，篩查乳腺癌患者，具有乳腺癌早期診斷的潛力的。Matsuda等[17]研究發現GPC-1的表達可以增強乳腺癌細胞系對不同肝素結合生長因子促有絲分裂和細胞增殖的反應，表明GPC-1的上調在乳腺癌進展中發揮作用。此外,MDA-MB-231乳腺癌細胞系GPC-1基因的表達使其更具有轉移潛力[18]。本研究通過分析乳腺癌組48例患者血清外泌體GPC-1表達水平與臨床特征的關系，發現GPC-1陽性與TNM分期、淋巴結浸潤和Ki-67高表達顯著相關，且GPC-1表達水平越高，腫瘤TNM分期越晚，呈正相關性。同時，我們對乳腺癌組治療20 d前后的血清外泌體GPC-1表達水平進行比較，發現治療后血清外泌體GPC-1表達水平下降且差異有統計學意義。血清外泌體GPC-1高表達與不良預后相關，且對治療反應敏感，可對乳腺癌的臨床診斷和預后評估提供參考。

本研究以病理檢查結果為金標準，構建了血清外泌體GPC-1診斷乳腺癌的ROC曲線，ROC曲線下面積為0.900，提示其可以作為乳腺癌的診斷標志物。血清外泌體GPC-1、血清腫瘤標志物、乳腺B超、鉬靶四種乳腺癌檢測方法一致性檢驗顯示血清外泌體CPC-1檢測結果與病理檢查結果一致性最高，敏感度高于血清腫瘤標志物，特異度高于乳腺B超和鉬靶，提示乳腺癌早期篩查可以將血清腫瘤標志物和血清外泌體GPC-1聯合應用，提高檢出率。影像學方法不易發現腫瘤患者早期病變且儀器場地限制不適合早期大規模篩查，而血清外泌體GPC-1檢測彌補了該方法的不足。

綜上所述，本研究發現血清外泌體GPC-1對乳腺癌的診斷有一定輔助價值，同時本研究也存在不足之處，標本量較少，下一步我們將深入研究外泌體來源的GPC-1在乳腺癌的作用機制，收集數據進行生存分析，進一步分析其在預后中的價值。