腫瘤源性外泌體在頭頸腫瘤免疫治療方面的研究進展

劉之暢，楊志超(綜述)，王建星，單春光(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科，河北 石家莊 050000)

頭頸腫瘤是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，超過90%的頭頸腫瘤是鱗狀細胞癌[1]。大量流行病學(xué)研究表明：煙草和酒精濫用以及人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染會導(dǎo)致頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的發(fā)生，但確切病因尚不清楚[2]。迄今為止，頭頸腫瘤的治療主要采用手術(shù)治療切除原發(fā)區(qū)癌組織及淋巴結(jié)，并配合以放療化療及使用細胞抑制劑。頭頸腫瘤早期癥狀不明顯且易轉(zhuǎn)移，患者術(shù)后1年生存率僅50%左右[3]。為了改善患者預(yù)后及術(shù)后生活質(zhì)量，亟須尋找可替代的早期診斷和治療方法。越來越多的研究表明，腫瘤源性外泌體(tumor-derived exosome,TEX)在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中對免疫抑制系統(tǒng)形成中具有重要作用。TEX上的表面配體能夠誘導(dǎo)受體細胞中的信號級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致TME中細胞的功能重編程并促進免疫抑制腫瘤相關(guān)免疫系統(tǒng)的形成[4]。現(xiàn)從TEX對TME中免疫系統(tǒng)的改變，來探討頭頸腫瘤的免疫治療。

1 外泌體的生物起源及作用

外泌體的研究可追溯到1946年由Chargaff和West提出的超微米胞外囊泡。隨著技術(shù)不斷創(chuàng)新，人們普遍認為超微米胞外囊泡可參與各種生理活動及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，直到1980年，科學(xué)家在大鼠網(wǎng)織紅細胞中開始報道了胞外囊泡的生物合成過程。1987年，Johnstone命名胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)為外泌體，并且直到90年代后期，外泌體的生物起源及結(jié)構(gòu)特征才被人們發(fā)現(xiàn)。

外泌體的定義基于囊泡大小及產(chǎn)生機制,目前分為三類：囊泡直徑<100 nm的稱之為外泌體；直徑為100～1 000 nm的囊泡稱為多囊泡(microvesicles，MVs)或脫落顆粒；>1 000 nm的囊泡稱為凋亡小體。現(xiàn)代人們大多接受的定義是由晚期核內(nèi)體向多泡體分化并隨后從細胞中釋放而產(chǎn)生的直徑<150 nm的小泡稱為“外泌體”。外泌體的生物起源是一個嚴格調(diào)控的過程:它始于早期核內(nèi)體向內(nèi)再生形成管腔內(nèi)囊泡(intra-luminal vesicles，ILVs)，進而成熟成為多囊泡體(multivesicular bodies,MVBs)；然后MVBs與各種細胞類型的細胞膜融合，在細胞外釋放ILVs作為外泌體，亦或被溶酶體或自噬體吞噬降解[5](圖1)。

圖1 外泌體的生物起源示意圖

外泌體主要由蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)構(gòu)成。不同細胞來源的外泌體擁有一些相同的蛋白質(zhì)如CD9、CD82、hsp70、hsp90等，這些可作為外泌體的生物標記物。不同細胞來源的外泌體帶有親族細胞的特性[6]，并充當腫瘤和免疫細胞的在腫瘤微環(huán)境內(nèi)和遠處穿梭的各種分子和因子的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[4]，在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用[7]。TEX內(nèi)核酸與靶細胞融合作用于受體細胞，可調(diào)節(jié)受體細胞的蛋白表達和信號通路[8]。TEX攜帶貨物的組成很復(fù)雜，除了含有親緣腫瘤細胞的細胞膜和胞質(zhì)成分，還包括多種蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸等。研究認為，TEX在受體細胞中遞送和處理內(nèi)容物的機制可能是通過TEX以細胞表面的配體-受體結(jié)合的方式或受體細胞吞噬TEX的方式進行的[4]。TEX膜表面富含共刺激分子和磷脂酰絲氨酸，它們不僅可以作為外泌體共同的分子標志物，還參與受體細胞對外泌體的有效攝取和細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2 TEX介導(dǎo)免疫抑制

TME主要是由腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的，是腫瘤細胞賴以生存的復(fù)雜環(huán)境，腫瘤細胞通過打造適合其生長的微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。不同細胞來源的外泌體可通過改變微環(huán)境影響受體細胞，進而影響機體的生物學(xué)功能。在頭頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，免疫抑制對腫瘤細胞的生存具有重要意義，也是臨床診療的難點。多項研究表明，TEX攜帶免疫抑制蛋白，改變受體免疫細胞的功能，導(dǎo)致免疫功能障礙。本節(jié)通過TEX對頭頸腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)的影響來探討頭頸腫瘤發(fā)展、侵襲的機制。

多項研究表明：在TME中，TEX與免疫抑制的發(fā)生密切相關(guān)。Ghalamfarsa等[9]研究發(fā)現(xiàn)，促進腫瘤逃脫免疫監(jiān)視的一個重要機制是通過嘌呤核苷酸和核苷等發(fā)出信號，這些信號在生理和病理條件下調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。生理上，腺苷平衡促炎ATP，產(chǎn)生抗炎作用，保護組織免受活化免疫細胞造成的損傷[10]；病理上，腫瘤中腺苷單磷酸酶(adenosine monophosphatase,AMPase)活性的增加導(dǎo)致腺苷的產(chǎn)生增加，使得TME發(fā)生深度免疫抑制，促進癌癥發(fā)生發(fā)展。此外，TEX能通過嘌呤能信號途徑與受體細胞相互作用，HNSCC產(chǎn)生的外泌體帶有嘌呤能信號途徑的成分，像外切核苷酸酶CD39和CD73[9]。這些具有功能活性的酶存在于正常人和頭頸腫瘤患者的血漿外泌體中，其含量在HNSCC患者的血漿中更高。CD39是一種細胞表面酶，其在腫瘤細胞、衰竭型T細胞和多抑制性細胞中高表達，是ATP水解和腺苷生成過程中的關(guān)鍵酶。免疫刺激分子ATP在CD39作用下轉(zhuǎn)化為單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，AMP在CD73作用下轉(zhuǎn)化為免疫抑制性腺苷，促進腫瘤免疫逃逸。此外，ludwig利用質(zhì)譜法分析了HNSCC患者和正常人血漿外泌體中嘌呤代謝物的含量，研究發(fā)現(xiàn)早期HNSCC患者嘌呤代謝物含量升高[11]，而晚期HNSCC和淋巴結(jié)受累患者的外泌體中嘌呤代謝產(chǎn)物水平降低。循環(huán)外泌體中嘌呤代謝物含量和水平的變化與疾病進展相關(guān)，其中最重要的免疫抑制嘌呤代謝物是腺苷。CD45僅在有核細胞中表達，而在鱗狀細胞癌中不表達，Beccard等[12]檢測了TME中CD45(+)細胞和CD45(-)細胞產(chǎn)生外泌體和腺苷的含量，結(jié)果顯示：CD45(-)細胞產(chǎn)生的外泌體含量遠高于CD45(+)細胞，且CD45(-)外泌體產(chǎn)生的腺苷濃度高于CD45(+)外泌體，外泌體中的腺苷主要生成自TEX。這些證據(jù)都指明TEX攜帶可以促進具有免疫抑制的腺苷的生成，TEX與頭頸腫瘤的免疫抑制密切相關(guān)。此外，富含腺苷的外泌體可促進腺苷A2BR介導(dǎo)的血管生成，進而促進頭頸腫瘤的侵襲、發(fā)展[13]。

TEX除了通過腺苷影響頭頸腫瘤的免疫抑制外，還作用于免疫T細胞介導(dǎo)免疫抑制。Beccard等[12]將活化的CD8+T細胞分別與HNSCC患者血漿外泌體和無外泌體對照組共同孵育，發(fā)現(xiàn)TEX中的CD8+T細胞凋亡數(shù)量顯著增加。而且晚期TEX孵育環(huán)境中，CD8+T細胞凋亡數(shù)量遠高于早期TEX孵育。CD69作為CD8+T細胞活化的標志，與CD45(+)外泌體相比，CD45(-)外泌體在CD8+T細胞中誘導(dǎo)了更強的CD69表達抑制，而CD45(+)外泌體對CD8+T細胞活性沒有明顯的抑制作用。值得注意的是，低分期和高分期患者的CD45(-)外泌體誘導(dǎo)了相似水平的CD69抑制。TEX除了通過減少CD8+T細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡來介導(dǎo)免疫抑制，還促進調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)的擴張、抑制活性和抵抗凋亡。CD39是調(diào)節(jié)性T細胞分化的標志，研究表明晚期患者TEX誘導(dǎo)的CD39明顯少于早期患者。TEX孵育后，T細胞中各種免疫應(yīng)答相關(guān)基因的mRNA表達發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為活化T細胞上CD69表達的減少和Tregs產(chǎn)生的免疫抑制腺苷的增加。此外，TEX還可以抑制CD4+T細胞的增殖。在HNSCC中,自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)促進免疫抑制，NK細胞表達Fc受體CD16，因此能夠參與抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用[14]。CD16(+)外泌體可以模擬NK細胞與抗體包覆的惡性細胞交聯(lián)的功能，而不執(zhí)行其細胞毒性功能,故可作為免疫抑制的介質(zhì)出現(xiàn)。另外，與腫瘤分期低的患者相比，腫瘤分期高和晚期的患者外泌體中CD16水平明顯更高。

T細胞在TME中免疫抑制的作用，已經(jīng)有很多研究證據(jù)證實。然而，B細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有爭議的，有研究表明調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells,Bregs)與腫瘤進展相關(guān)，并抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[15]。然而迄今為止，尚無證據(jù)表明源自HNSCC的TEX對B細胞的作用。有研究[16]為了驗證TEX對TME中B細胞免疫抑制的影響，從健康個體中分離B細胞，并與從正常個體和HNSCC患者獲得的血漿外泌體共培養(yǎng)4 d。之后分離B細胞并通過流式細胞術(shù)進行分析，結(jié)果表明從HNSCC組分離出的B細胞中程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)和淋巴細胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG3)的表達顯著增加，但是二者均可導(dǎo)致B細胞功能抑制，并無顯著性差異。此外，研究表明，來自健康個體的外泌體和來自HNSCC患者的外泌體均攜帶免疫抑制貨物，例如PD-L1，凋亡相關(guān)因子配體(factor related apoptosis ligand，F(xiàn)asL)和細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)[17]等。TEX還可以通過這些免疫抑制蛋白介導(dǎo)免疫抑制。

PD-1/PD-L1通路是一種在TME中起作用的重要免疫抑制機制，為HNSCC基于抗體的免疫治療提供了一個有前景的藥物靶點[18]。從HNSCC患者血漿中提取的外泌體攜帶具有生物活性的PD-L1，抑制活化的T細胞[19]的功能。Theodoraki等[19]研究表明：外泌體上PD-L1的相對水平與疾病活性、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在有關(guān)；外泌體PD-L1水平高的患者為活動性或晚期疾病，PD-L1水平高的外泌體強烈抑制T細胞活性，而低PD-L1水平的外泌體則沒有。Theodoraki等[19]在與外泌體孵育前，在T細胞培養(yǎng)基中加入抗PD-1抗體，幾乎完全逆轉(zhuǎn)了這種免疫抑制效應(yīng)。與外泌體包裹的PD-L1相比，可溶性PD-L1水平對臨床結(jié)果并無影響。與整合在外泌體膜中的穩(wěn)定PD-L1相比，未受保護的可溶性PD-L1的蛋白質(zhì)降解增加。因此，外泌體內(nèi)的PD-L1成為一種很有前途的HNSCC疾病進展的生物標志物。總的來說，在HNSCC的腫瘤微環(huán)境中，TEX對免疫功能的影響非常大。

3 免疫治療

TEX通過各種途徑促進免疫抑制，并通過各種耐藥機制逃避免疫反應(yīng)，導(dǎo)致頭頸腫瘤患者預(yù)后不佳。國際上，局部晚期HNSCC的常規(guī)治療方法是手術(shù)治療，然后進行風險適應(yīng)性輔助放化療或者定性放化療。近年來，臨床關(guān)于腫瘤免疫治療的研究十分火熱，部分免疫治療藥物也獲批成為一線治療藥物(nivolumab和pembrolizumab)。腫瘤免疫治療主要通過增強或激活淋巴細胞殺傷腫瘤細胞從而達到抑制或消除腫瘤細胞的目的。頭頸腫瘤是免疫浸潤最為嚴重的疾病之一，免疫療法也成為HNSCC的新方向。FDA目前批準的免疫療法主要包括腫瘤疫苗、細胞因子、CAR-T療法、及免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICI)。免疫檢查點是復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑的穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，介導(dǎo)免疫系統(tǒng)對靶細胞的激活或選擇性耐受。HNSCC的免疫療法主要針對T細胞抑制受體，這些受體作為免疫檢查點，負責維持激活和抑制免疫反應(yīng)之間的平衡。目前HNSCC的主要免疫檢查點有PD-1、CTLA-4、LAG-3等。

3.1抗PD-1/PD-L1單抗治療 基于細胞毒性T細胞ICI的免疫療法已被證明在HNSCC中是有效的。目前，關(guān)于HNSCC的免疫檢查點主要為PD-1/PD-L1，在3期臨床試驗中也已經(jīng)驗證了抗PD-1藥物nivolumab和pembrolizumab的療效，并被批準用于復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移HNSCC的一線治療。KEYNOTE-048[20]研究表明：在復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的晚期頭頸癌中，pembrolizumab單藥或聯(lián)合化療使用的效果優(yōu)于EXTREME(西妥昔單抗聯(lián)合化療)方案。Pembrolizumab單藥治療改善了PD-L1綜合陽性評分(combined positive score，CPS)≥1的HNSCC患者的總生存率，被FDA批準用于PD-L1CPS≥1的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性HNSCC的一線治療藥物。抗PD-1藥物使用的生物標志物主要是PD-L1表達，此外，腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)、HPV感染狀態(tài)可能也存在一定相關(guān)性。在一項包含40例頭頸鱗癌[19]患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)患者循環(huán)外泌體PD-L1水平與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)高度相關(guān)(P<0.001，0.013)，循環(huán)外泌體PD-L1水平可間接反映患者疾病進展及免疫功能，可作為頭頸鱗癌病情的監(jiān)測指標。

TMB一般指特定基因組區(qū)域內(nèi)每兆堿基對體細胞非同義突變的個數(shù)[21]，可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新抗原的能力和程度，已被證實可預(yù)測多種腫瘤的免疫治療療效。腫瘤特異性突變基因可產(chǎn)生新的蛋白，這些蛋白或其降解產(chǎn)物被主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)遞呈至腫瘤細胞表面形成腫瘤新抗原，然后被活化的CD8+T細胞識別，從而觸發(fā)靶向腫瘤的免疫反應(yīng)，因此腫瘤基因突變被認為是抗腫瘤免疫治療的前提。在對126例接受PD-1/PD-L1治療的HNSCC患者的回顧性分析[22]中，應(yīng)答性患者的TMB較高(21.3：8.2 mut/MB；P<0.01)并且與HPV(-)腫瘤的中位總生存率增加相關(guān)(TMB>10 mut/MB,總生存率為10個月；TMB<5 mut/MB,總生存率為6個月；P=0.01)。越來越多的數(shù)據(jù)證實TMB越高的腫瘤新抗原負荷越高，更有可能從ICIs治療中獲益。2020年6月16日，F(xiàn)DA基于Ⅱ期KEYNOTE-158試驗結(jié)果正式批準TMB作為免疫治療的生物標志物。

此外，Oliva等[23]研究表明：HPV(+)HNSCC患者相較HPV(-)HNSCC患者免疫抑制微環(huán)境更弱、淋巴細胞浸潤(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)比例更高、CD8+T細胞比例更高、Treg更少。在pembrolizumab的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中，HPV(+)患者緩解率為22%，而HPV(-)緩解率為16%。KEYNOTE-055[24]試驗中，緩解率分別為32%和14%。然而，checkmate-141臨床試驗中，研究數(shù)據(jù)表明HPV感染與頭頸腫瘤患者總生存率無統(tǒng)計學(xué)差異。

3.2抗CTLA-4單抗治療 抗PD-1治療補充了HNSCC傳統(tǒng)治療，提高了患者中位總生存率和ORR。抗PD-1治療最大缺點是不良反應(yīng)率達10%～30%[25]，關(guān)于抗PD-1藥的聯(lián)合療法正在積極研究。在HNSCC中，與抗PD1/PD-L1治療相結(jié)合的最令人期待的藥物之一是抗CTLA-4治療。CTLA-4是T細胞跨膜受體，可與B7分子配體結(jié)合誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞抑制，負向調(diào)控免疫反應(yīng)[26]。腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制分子轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor beta，TGF-β)也可上調(diào)CTLA-4的表達。CTLA-4單抗可阻斷其與B7的結(jié)合，提高HNSCC的抗腫瘤效應(yīng)。盡管在HNSCC中單藥具有抗CTLA4活性的證據(jù)有限，但在HNSCC的抗PD1/PD-L1治療中添加抗CTLA4藥物的聯(lián)合研究進展迅速。在Ⅱ期CONDOR[27]和Ⅲ期EAGLE[25]試驗中，都將抗CTLA-4抗體durvalumab單獨或與tremelimumab聯(lián)合使用。比較遺憾的是：在Ⅲ期EAGLE試驗中，與化療藥物(西妥昔單抗、紫杉醇、甲氨蝶呤)相比，durvalumab聯(lián)合tremelimumab治療并不能改善總生存率(HR 1.04，95%CI：0.85～1.26)。但是，Durvalumab單藥治療組的反應(yīng)持續(xù)時間和2年生存期得到改善，表明該藥物在HNSCC治療中具有活性。目前，PD-1與CTLA-4聯(lián)合治療的2/3期臨床試驗，還沒有產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。

Theodoraki等[28]納入18例HNSCC患者，進行Ⅰ期臨床試驗接受西妥昔單抗，伊匹單抗和放療聯(lián)合治療。對TEX和T細胞來源的外泌體進行了連續(xù)監(jiān)測，將從血漿中分離出的外泌體通過免疫捕獲分離為TEX和CD3+T細胞來源的外泌體。比較腫瘤在2年內(nèi)復(fù)發(fā)(n=5)的患者的外泌體分子貨物與在治療后2年仍無疾病的患者(n=13)的貨物，結(jié)果表明治療后外泌體內(nèi)CTLA-4含量下降。這些數(shù)據(jù)表明TEX和T細胞衍生的循環(huán)外泌體可以代替免疫細胞來監(jiān)測患者對腫瘤治療的反應(yīng)。外泌體有可能作為癌癥的非侵入性腫瘤和免疫細胞生物標記物。

4 結(jié)論與展望

外泌體攜帶的分子貨物具有親緣細胞屬性，HNSCC中TEX根據(jù)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移需要形成TME。TEX主要通過損傷免疫細胞浸潤、招募調(diào)節(jié)性T細胞、產(chǎn)生腺苷等途徑介導(dǎo)免疫抑制。此外，循環(huán)外泌體不僅在免疫抑制中發(fā)揮重要作用，而且可以用作HNSCC早期診斷指標，并可作為免疫治療的預(yù)測指標。

與已建立的治療方法相比，免疫療法正在迅速改變HNSCC的治療前景，提高了生存率并降低了毒性。目前，主要的免疫治療仍然是免疫檢查點抑制劑,ICI已從R/M HNSCC的二線治療發(fā)展為一線治療。抗PD-1藥nivolumab和pembrolizumab可以顯著延長生存期，但是耐藥性和不良反應(yīng)仍然是臨床應(yīng)用的一大難點。學(xué)者們正在研究ICI的聯(lián)合應(yīng)用，以確定是否有更多患者可以從中受益。關(guān)于ICI在局部晚期腫瘤中使用的試驗，如針對TIM-3、LAG-3、CTLA-4等抑制性免疫檢查點的藥物單藥治療或聯(lián)合應(yīng)用，并且可能帶來突破性變化的Ⅲ期臨床試驗正在積極進行中。