雷公藤甲素生殖毒性及其防治策略研究進展

李英奇，王 恒，李嫚琪，楊紫軒，許瀚林，常 艷

（1.上海工程技術大學化學化工學院，上海 201620；2.中國醫藥工業研究總院上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 201203；3.復旦大學藥學院，上海 201203）

雷公藤甲素是一種二萜三環氧化物，可從雷公藤的根、葉、花及果實中提取，是雷公藤中最主要的生物活性成分，也是迄今發現的功能、活性較強的抗炎和免疫調節天然產物之一［1］。由于其在抗癌［2］、抗炎［3］和免疫抑制［4］等方面的良好作用，臨床上已將雷公藤甲素用于治療腫瘤［5］及類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）［6］和系統性紅斑狼瘡［7］等自身免疫疾病。然而，其對生殖系統、肝、腎、心臟和胃腸道等存在嚴重不良作用［8］，其中，生殖系統毒性主要表現為精子數量和活力下降［9］及卵泡凋亡［10］等。目前臨床投入使用的雷公藤甲素單體制劑較少，常用的含雷公藤甲素的藥物主要有雷公藤片和雷公藤多苷片等［11］，但不同廠家的藥物中雷公藤甲素含量相差較大［12］，且生殖毒性和作用機制尚不明確，限制了其臨床應用。因此，對雷公藤甲素的生殖毒性、作用機制和增效減毒措施的研究具有重要臨床意義。

1 生殖毒性

雷公藤甲素的雄性生殖毒性主要體現在損害精子和睪丸細胞，及擾亂雄性激素等，其雌性生殖毒性主要體現在破壞子宮和卵巢的正常生理功能。

1.1 精子損傷

雷公藤甲素對生殖系統的影響之一是對精子的損傷。Ma等［13］報道，雄性小鼠ip給予雷公藤甲素60 μg·kg-12周后，小鼠附睪中精子數量減少。Wang等［9］ig給予雄性SD大鼠雷公藤甲素50和100 μg·kg-190 d后，大鼠精子密度和活力均顯著降低。黃鄭雋等［14］ig給予雄性Wistar大鼠雷公藤甲素25，50和100 μg·kg-130 d后，大鼠精子畸形率顯著增加，精子頭部發生明顯畸形，表現出無頭、細長型、無定型和無鉤等類型。Xiong等［15］ig給予C57BL/6J小鼠雷公藤甲素50 μg·kg-135 d后，小鼠精子畸形率增加約45.75%。

1.2 睪丸細胞損傷

雷公藤甲素可在睪丸中顯著累積，睪丸是其最主要的靶器官［16］。雄性小鼠ip給予雷公藤甲素60 μg·kg-12周后，小鼠睪丸生殖細胞明顯脫落、減少［13］。Hu等［17］用雷公藤甲素20，40和60 nmol·L-1處理SD大鼠間質細胞，間質細胞活力下降并發生凋亡。Wang等［9］從SD大鼠睪丸分離支持細胞和生殖細胞進行共培養，與雷公藤甲素5，25，125，625和3000 nmol·L-1共孵育。結果表明，與細胞對照組相比，625和3000 nmol·L-1組支持細胞活力顯著降低，支持細胞與生殖細胞的黏附連接被破壞，而5，25和125 nmol·L-1組未觀察到顯著差異。Zhang等［18］利用接近抗腫瘤劑量的雷公藤甲素（0.02，0.1，0.5和2.5 μmol·L-1）與小鼠支持細胞和小鼠精母細胞系（GC-2spd和GC2）共同孵育，結果表明，雷公藤甲素可使支持細胞和GC2的活力降低，并發生凋亡和自噬。Wang等［19］將小鼠支持細胞用雷公藤甲素 0.05，0.1，0.5，1 和 5 μmol·L-1處理24 h，發現雷公藤甲素可導致支持細胞收縮或失去黏附能力。

1.3 卵巢和子宮損傷

Zeng等［10］為確定雷公藤甲素25和50 μg·kg-1對卵巢功能的影響，在10 d內檢測了NIH小鼠的發情周期，發現ig給予雷公藤甲素的小鼠發情周期延長，但發情期縮短。病理結果顯示，雷公藤甲素組小鼠卵巢表面萎縮、蒼白、粗糙，卵巢的初級卵泡、次級卵泡、原始卵泡和成熟卵泡數量減少。Tang等［20］ig給予19日齡雌性C57BL/6小鼠雷公藤甲素 30，60 和 90 μg·kg-1，發現小鼠子宮重量顯著降低，HE染色見子宮上皮細胞變性和壞死。

2 生殖毒性機制

近年來隨著對雷公藤甲素生殖毒性的研究，研究者們已發現多種雷公藤甲素生殖毒性作用機制，如引起細胞內氧化應激、損傷線粒體和破壞細胞骨架與細胞間的粘附連接等。

2.1 引起氧化應激和線粒體損傷

氧化應激和線粒體損傷是雷公藤甲素引發睪丸毒性的重要原因，并影響精子功能。Hu等［17］報道，雷公藤甲素誘導的氧化應激是引起睪丸間質細胞毒性作用的原因，與氧化應激相關的線粒體膜電位和細胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）分別降低和增加。此外，凋亡相關的蛋白Bcl-2、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達，共同引發線粒體損傷，最終致使細胞凋亡。有關雷公藤甲素對支持細胞影響的研究很少，其毒性的分子機制尚不清楚。Wang等［19］報道了雷公藤甲素誘導睪丸支持細胞毒性的機制，發現支持細胞中的線粒體死亡介導睪丸毒性，而線粒體死亡是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）/c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑激活和核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）途徑抑制所介導，導致抗氧化系統失活，觸發線粒體死亡，引發細胞凋亡。Cheng等［21］研究了線粒體功能和代謝與雷公藤甲素誘導支持細胞毒作用的相關性。結果表明，雷公藤甲素通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α〔peroxisome proliferator activated receptor（PPAR）-γ coactivator-1α，PGC-1α〕活性、抑制Sirtuin 1蛋白水平、調節絲裂原活化蛋白激酶水平，引發線粒體功能障礙，導致睪丸毒性。而線粒體損傷減少乳酸的產生，使脂肪酸代謝失調，導致生殖細胞能量不足，進一步導致睪丸毒性。

2.2 破壞細胞間肌動蛋白的黏附連接

支持細胞骨架是睪丸毒物的主要靶點之一，支持細胞中Rho家族的小分子Rho GTP酶可以調節細胞骨架和連接。Wang等［9］研究結果顯示，雷公藤甲素通過抑制Rho GTP酶的表達，破壞細胞骨架以及細胞之間的黏附連接，導致精子功能障礙，是生殖細胞損傷的主要原因。為了明確潛在的調控途徑，他們還檢測了Rho GTP酶最重要的下游分子Rho相關激酶Rock的表達，結果表明，雷公藤甲素使Rock1和Rock2mRNA水平降低，提示Rho-Rock可能參與了生殖毒性的調節。

2.3 導致睪酮和關鍵酶水平下降

睪丸支持細胞和間質細胞標志酶分別為6-磷酸葡萄糖脫氫酶和β-葡萄糖醛酸苷酶，其活力水平會影響細胞的生理功能。線粒體標志酶琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、溶酶體標志酶酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、生精上皮細胞標志酶乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和精子能量利用的主要酶腺苷三磷酸酶與生精能力、生精過程和精子運動相關。雷公藤甲素會使這些標志酶的活性明顯下降，導致支持細胞和間質細胞損傷，從而可能導致睪酮分泌減少，損害生精功能，是雄性生殖功能損傷的一個重要機制［14］。Ma等［13］研究發現，雄性小鼠ip給予雷公藤甲素以60 μg·kg-1后，睪丸組織中的睪酮、SDH、ACP和LDH水平降低。

2.4 導致關鍵蛋白表達異常

雷公藤甲素還會引起某些蛋白表達異常，從而導致睪丸毒性。在睪丸中表達的乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）可以影響藥物在睪丸中的分布，但其在雷公藤甲素誘導的睪丸損傷中的作用尚不明確。Li等［16］運用bcrp基因敲除FVB小鼠進行研究，發現雷公藤甲素會降低睪丸中BCRP mRNA和蛋白水平，進一步增加雷公藤甲素在睪丸中的含量，增強毒性作用。在細胞代謝調節中發揮重要作用的PPAR可能是導致精子功能障礙和支持細胞代謝異常的關鍵調控因子。Ma等［13］利用氣相色譜-質譜聯用技術從分子水平研究了小鼠給予雷公藤甲素后睪丸組織代謝物變化，發現雷公藤甲素可介導PPAR下調，使睪丸脂質和能量代謝異常，導致精子損傷。

雷公藤甲素的雌性生殖毒性機制也與蛋白質的表達異常相關。Zheng等［22］通過構建分子網絡研究雷公藤甲素的雌性生殖毒性，發現半胱氨酸蛋白酶3、TP53和MYC靶向蛋白可以調控卵巢中21個蛋白的表達，是引起雌性生殖毒性的主要原因，但還需要在動物體內進一步驗證。此外，卵巢中內質網應激相關蛋白表達上調，X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein）表達抑制［10］，雌激素受體 α和孕激素受體表達下調都是雷公藤甲素誘導的卵巢毒性的潛在機制［20］。

2.5 導致長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環狀RNA（circular RNA，cRNA）、mRNA和微RNA（microRNA，miRNA）表達異常

黃鄭雋等［23］研究發現，凋亡基因Bax、Fas、FasL、胱天蛋白酶3及抑制凋亡基因Bcl-2和環腺苷酸反應成分調節蛋白的表達異常，很可能是誘導大鼠生殖細胞凋亡的重要原因。此外，還有一些RNA也可能與雷公藤甲素的生殖毒性相關。lncRNA和cRNA在內的非編碼RNA是一種新型調控分子，與多種生理活動相關，對男性生育能力至關重要，然而是否與雷公藤甲素誘導的生殖毒性有關尚不清楚。Xiong等［15］通過RNA測序獲得雷公藤甲素誘導的雄性生殖毒性小鼠的全基因組lncRNA、cRNA和mRNA表達譜，發現雷公藤甲素給藥組小鼠睪丸中檢測到部分lncRNA，cRNA和mRNA表達失調，提示其可能是雷公藤甲素誘導生殖毒性的標志物。為進一步研究特定lncRNA在雷公藤甲素誘導的GC2細胞毒性中的作用，Zhang等［18］選擇Obox4-ps35（最顯著上調的lncRNA之一）進行研究，發現敲除Obox4-ps35可以保護該細胞避免雷公藤甲素誘導的毒性，但仍需進一步研究闡明具體機制，并確定這種lncRNA調控的特定靶基因或信號通路。miRNA是一種小的內源性非編碼RNA分子，參與細胞凋亡、分化和存活等過程。Han等［23］構建體外細胞模型研究生精障礙患者中顯著上調的miR-200a在生精障礙中的調節機制。結果顯示，miR-200a下調可保護間質細胞，也可通過觸發自噬來改善雷公藤甲素誘導的小鼠睪丸間質細胞瘤細胞凋亡和氧化應激。

3 防治策略

雷公藤甲素具有抗炎、抗癌等藥理活性，然而其生殖毒性限制了其臨床應用。為發揮雷公藤甲素的臨床應用價值，有必要對其生殖毒性緩解措施進行研究。目前主要包括研發雷公藤甲素緩解毒性藥物、對其進行結構修飾及開發新型遞藥系統等。

3.1 尋找潛在的抗毒配伍藥物

槲皮素是具有氧化應激保護功能的黃酮類化合物之一。Hu等［17］用雷公藤甲素（20，40和60 nmol·L-1）處理睪丸間質細胞24 h，引起明顯的氧化應激；而將槲皮素（2.5，5，10和20 μmol·L-1）與雷公藤甲素聯合給藥24 h后，槲皮素 5 μmol·L-1可顯著提高間質細胞活力，其作用機制與ROS減少、線粒體膜電位下降和Cyt-c釋放減少、凋亡相關蛋白（Bax、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3）表達下調相關。Zhang等［24］研究也發現，靶向線粒體的抗氧化劑MitoQ（1.3，2.6和5.2 mg·kg-1）與雷公藤甲素120 μg·kg-1分別ig或ip給予雄性ICR小鼠14 d后，可以保護血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）完整性、睪丸組織的微觀結構和精子形態。MitoQ可激活腫瘤抑制因子Keap1-Nrf2抗氧化防御系統，上調線粒體融合蛋白2和動力相關蛋白1的表達，并對線粒體產生保護作用，進而抑制雷公藤甲素誘導的生殖毒性。

用于預防和治療男性不育癥的傳統藥用植物杜仲的活性成分桃葉珊瑚苷也可能緩解雷公藤甲素生殖毒性。Ma等［25］ip給予雄性小鼠雷公藤甲素120 μg·kg-1，1 h后ip給予不同劑量桃葉珊瑚苷（5，10和20 mg·kg-1，發現桃葉珊瑚苷可減少雷公藤甲素誘導的睪丸損傷、細胞凋亡、精子形態異常和BTB破壞。桃葉珊瑚苷通過抑制蛋白激酶R樣內質網激酶/核轉錄因子和JNK途徑預防凋亡，通過上調緊密連接蛋白（ZO-1，occludin和claudin-11）和間隙連接蛋白43的表達保護BTB的完整性。

含木犀草素的蔬菜和水果顯示出對男性生殖系統的有益作用。Ma等［26］用木犀草素2.5，5和10 μmol·L-1與雷公藤甲素 500 nmol·L-1共同處理小鼠支持細胞，發現木犀草素可通過激活細胞氧化應激的重要轉錄因子Nrf2的轉錄活性并上調間隙連接蛋白43的表達，減少雷公藤甲素導致的睪丸損傷。

3.2 對化學結構進行修飾

對雷公藤甲素進行化學結構修飾可以降低其生殖毒性，提高其穩定性和治療效果。Qi等［27］將雷公藤甲素結構修飾成雷公藤內酯氨基糖苷（triptolide aminoglycoside，TPAG），在治療雄性昆明小鼠腎缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）的研究中，TPAG進入動物體內后24 h內保持穩定，與雷公藤甲素相比，可在更低劑量（0.22 mg·kg-1）有效治療IRI。睪丸組織病理檢測結果顯示，TPAG組精子及間質組織形態正常，病理變化很小，而雷公藤甲素組生殖細胞嚴重退化、剝離，生精小管萎縮。Fu等［28］對雷公藤甲素進行結構修飾得到其衍生物ZT01，在治療雄性C57BL/6小鼠炎癥性腸病的研究中，ZT01在0.1，0.3和1.0 mg·kg-1可劑量依賴性改善炎癥性腸病相關癥狀，治療效果優于雷公藤甲素0.1 mg·kg-1，且降低了對睪丸的毒性，但ZT01的相關毒性和機制還需進一步研究。

3.3 開發新型納米遞送系統

使用納米遞送系統遞送藥物是一種有效降低雷公藤甲素毒性的方式，納米遞送方法不僅治療劑量低于化學結構修飾方法，毒性也相對較低。Huang等［29］開發了負載雷公藤甲素的納米顆粒（TP-F127/P123 nanoparticles，TP-FPNP），在雄性IRI模型小鼠上，TP-FPNP具有良好的腎靶向性，被腎小管細胞吞噬后，可緩慢釋放雷公藤甲素，從而實現IRI治療。該研究表明，TP-FPNP與雷公藤甲素相比，穩定性較好，且療效顯著、毒性較低。Deng等［30］開發了另外一種包封雷公藤甲素的納米顆粒（triptolide-encapsulated mesoscale nanoparticles），在雄性IRI模型小鼠上，不僅腎靶向能力強，且在極低劑量（0.01 mg·kg-1）便具有良好療效，與雷公藤甲素相比，生殖毒性較低。Zhang等［31］設計的半乳糖基化殼聚糖-雷公藤甲素-納米顆粒（galactosylated-chitosan-TP-nanoparticles），在人肝細胞癌細胞系荷瘤裸鼠上顯示出比雷公藤甲素更好的療效，可有效抑制癌癥發展，有效降低雷公藤甲素的雄性生殖毒性。Liu等［32］開發的雷公藤甲素負載納米藥物（TP-loaded nanomedicine，TP@NP），在Ⅱ型膠原誘導性關節炎模型小鼠上表現出顯著的軟骨保護和抗炎作用，且TP@NP給藥組小鼠子宮內膜厚度均勻，細胞核相對完整，接近正常小鼠。將RAW264.7細胞用雷公藤甲素40 nmol·L-1或TP@NP（含40 nmol·L-1雷公藤甲素）處理24 h后，TP@NP與游離雷公藤甲素相比，減少了細胞毒性和細胞凋亡。

4 結語

雷公藤甲素對生殖系統產生的不良反應主要表現為精子活力和生育能力下降、睪丸萎縮、睪丸細胞凋亡、卵泡數量減少和排卵功能損傷等，其毒性機制與氧化應激、線粒體損傷、細胞間肌動蛋白黏附連接破壞、酶（包括6-磷酸葡萄糖脫氫酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、SDH、ACP、LDH和腺苷三磷酸酶）活力下降及蛋白（包括BCRP、PPAR、胱天蛋白酶3TP53MYC靶向蛋白、連鎖凋亡抑制蛋白、雌激素受體α和孕激素受體）表達異常等因素相關。針對雷公藤甲素的毒性作用，人們嘗試用多種方法減輕其對生殖系統的損傷，如將其與緩解毒性藥物聯用、對其進行結構修飾、開發新型遞藥系統等。盡管取得諸多進展，但其生殖毒性及作用機制仍不十分明確，且其與緩解藥物的實驗劑量難以準確應用于臨床；結構修飾和遞送系統的研究目前也僅處于動物模型實驗階段。因此，還需進一步研究緩解雷公藤甲素不良反應并提高其藥效的措施，以滿足臨床應用的需求。