ICP-MS測定羅庫溴銨原料藥中11種元素雜質含量

張玉蘭， 何 超， 陳旭紅， 樊東生， 胡雅琴， 錢杉杉

(1. 中國測試技術研究院，四川 成都 610021; 2. 成都新恒創藥業有限公司，四川 成都 610021)

0 引 言

元素雜質主要是指藥品生產或貯藏過程中生成、加入或無意引入的物質，包括可能存在于原料藥、輔料或制劑中的催化劑和環境污染物。由于某些元素雜質具有毒性，且可誘導藥物降解，對藥品的穩定性、保質期產生不利影響，因此各國藥品監督管理機構對藥品元素雜質的控制愈發嚴苛[1-2]。

人用藥物注冊技術要求國際協調會議（international conference on harmonization，ICΗ）于 2014年 11月發布的《元素雜質指南Q3D》（ICΗ Q3D），旨在為新藥制劑和其賦形劑中元素雜質的定性和定量控制提供全球性方針，為口服、注射和吸入制劑中的 24個元素雜質建立了日允許暴露量（PDE）[3]。

藥品中的元素雜質主要來源于金屬催化劑殘留，生產設備或容器密閉系統相互作用產生，或由包裝系統引入。羅庫溴銨（Rocuronium bromide）是全身麻醉輔助用藥，用于常規誘導麻醉期間氣管插管，以及維持術中骨骼肌的神經肌肉阻滯，為短期用藥。根據ICΗ Q3D中“5.4風險評估建議考慮的元素”并結合元素雜質的毒性、出現的概率和引發風險的高低，羅庫溴銨原料藥中可能存在的24 種元素雜質分為 3 類，其合成工藝中沒有使用金屬催化劑，無需對2B類元素進行風險評估，但起始物料合成工藝過程中使用了硼氫化鈉，可能引入硼(B)。因此，為保證藥品質量和用藥安全，根據ICΗ Q3D評估要求，應對羅庫溴銨原料藥中鎘(1類)、鉛(1類)、砷(1 類)、汞 (1 類)、鈷 (2A 類)、鎳 (2A 類)、釩 (2A 類)、鋰(3類)、銻(3類)、銅(3類)、硼(4類)11種元素雜質進行評估。

元素雜質的測定方法主要有原子吸收分光光度法（AAS）、原子熒光光度法（AFS）、電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）。其中，AAS法和AFS 法一次只能測定1～2個元素，且部分元素在測定時需要加入合適的試劑，操作過程繁瑣、測定效率低；ICP-OES法雖能同時測定多個元素，但其檢出限較高，不能滿足1類元素雜質的限度要求；ICP-MS法檢測的濃度可低至ng·kg-1級，且線性范圍寬、抗干擾能力強，還能提供精確的元素同位素信息，目前已廣泛應用于藥品行業中元素雜質控制[4-6]。鑒于目前尚無針對羅庫溴銨原料藥元素雜質含量的檢測方法，本研究擬建立ICP-MS法測定羅庫溴銨原料藥中上述11種元素雜質檢測方法，方法學驗證過程符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）9101分析方法驗證指導原則要求[7]。

1 試驗部分

1.1 儀器

安捷倫電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，Agilent Technologies 7800，USA)；微波消解儀(CEM，55 mL消解管)；十萬分之一電子天平（MCA125P-2CCN-U，賽多利斯）；超純水發生器(Milli-Q Synthesis MILLIPORE，USA)；試劑純化系統（Analab，France）；趕酸儀（BΗW-09C，上海博通化學科技有限公司）。

1.2 試劑

硝酸(GR級，經BΗW-09C趕酸儀純化)；實驗用水均為超純水 (電阻率＞18 M·cm)；汞 (Ηg)、鎘(Cd)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳 (Ni)、銅(Cu)、鋰 (Li)、銻 (Sb)、硼 (B)、金（Au）單元素標準溶液，濃度均為 1 000 μg·mL-1，生產商為國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.3 供試品

羅庫溴銨原料藥，由成都新恒創藥業有限公司提供（批號：Z16621702）。

2 方法與結果

2.1 元素雜質限度要求

參照 ICΗ Q3D 指導原則的要求，羅庫溴銨原料藥中 As、Cd、Ηg、Pb、Co、V、Ni、Cu、Li、Sb、B 11個元素的PDE值和限度值如表1所示。

表1 元素PDE值和限度值

2.2 儀器參數

ICP-MS儀器工作條件如表2所示。

表2 Agilent Technologies 7800 ICP-MS 工作參數

2.3 溶液制備

2.3.1 加標用混合母液

根據元素雜質限度要求（表1），其中限度濃度大于5 mg/g的元素均以5 mg/kg計，配制加標用混合母液：鎘 (Cd)、汞 (Ηg)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷(As)、鎳(Ni)濃度分別為200，300，500，500，1 000，1 500 ，2 000 ng/mL，以及銅 (Cu)、銻 (Sb)、鋰 (Li)、硼 (B)濃度均為 5 000 ng/mL，介質為 10%ΗNO3溶液。

2.3.2 標準曲線溶液的制備

1）標準溶液中間液：吸取加標用混合母液（2.3.1）1.25 mL，用含有 10 ng/mL金（Au）的 2%ΗNO3溶液稀釋至25 mL定量管中，搖勻。

2）標準曲線工作溶液：取8支25 mL定量管，分別加入不同體積標準溶液中間液，用2% ΗNO3溶液（含10 ng·mL-1金元素降低汞的記憶效應，同時保證溶液穩定性[8]）定容至刻度線，搖勻，即得標準曲線工作溶液。其中，Cd、Ηg、Co、Pb、V 標準曲線工作溶液濃度為 0.00，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL，As、Ni、Cu、Sb、Li、B 標準曲線工作溶液濃度為 0.00，1.0，2.50，5.0，10.0，25.0，50.0 ng/mL。

2.3.3 供試品溶液制備

稱取羅庫溴銨原料藥樣品（批號：Z16621702）0.10 g（精確至0.0001 g）于消解管中，加入6 mL ΗNO3后搖勻，于120 ℃預消解1 h，待冷卻至室溫后加蓋擰緊放入微波消解儀（消解程序參考表3）；消解完成后，取出消解管，在趕酸儀上120 ℃趕酸至溶液約為1 mL。冷卻后，用含有10 ng/mL金（Au）的水溶液分少量多次將消解液轉移至25 mL定量管中，搖勻后待測。不加樣品，同法制備試劑空白。

表3 微波消解程序

2.3.4 加標供試品溶液制備

稱取羅庫溴銨原料藥（批號：Z16621702）樣品約0.10 g（精確至0.0001g）于微波消解管中，加入0.10 mL 加標用混合母液（2.3.1），再加入 6 mL ΗNO3，其余步驟同2.3.3。

2.4 測試方法

鋰(Li)、硼(B)采用NO Gas模式分析，其他元素采用Ηe模式分析，外標法定量。

2.5 方法學驗證

2.5.1 專屬性試驗

采用ICP-MS法對樣品中的元素進行分析測試時，樣品中存在的其他成分或元素可能對目標元素的測定造成基體干擾。為了考察基體干擾對測定結果的影響，取試劑空白、供試品溶液（2.3.3）、加標供試品溶液（2.3.4）、標準曲線溶液分別進行半定量掃描分析。

以試劑空白、加標試劑空白、供試品溶液、加標供試品溶液中各目標元素的強度值，按下式(1)、(2)進行計算來分析干擾情況，結果如表4所示。

從表4結果可以看出，試劑空白中11種元素在100%加標試劑空白中的占比均小于10%，說明試劑空白的干擾較低；供試品溶液對11種元素的基體干擾均低于15%，能滿足專屬性要求。

表4 元素的基體干擾測試結果

2.5.2 檢測限與定量限試驗

根據國際純粹與應用化學會（international union of pure and applied chemistry, IUPAC）規則，重復測定試劑空白（2.3.3）11次，取3倍標準偏差值為檢測限，取10倍標準偏差值為定量限，并遵循“只入不舍”原則。按照稱樣量0.1 g和定容體積25 mL換算為含量，以含量計算定量限，如表5所示，11種元素的定量限均低于羅庫溴銨原料藥中各元素雜質限度要求（表1），能夠滿足限度測試需求。

表5 檢測限與定量限

2.5.3 線性與范圍試驗

將標準曲線工作溶液（2.3.2）由低濃度至高濃度依次泵入ICP-MS分析，采用外標法繪制校正曲線，儀器定量限至標準曲線濃度上限即為該方法線性范圍。外標法以標準溶液濃度為橫坐標，強度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算相關系數。結果如表6所示，11種元素在儀器定量限至標準曲線濃度上限的線性范圍內線性關系良好，線性相關系數均大于0.999。

表6 線性與范圍及相關系數

2.5.4 精密度試驗

1）重復性試驗

經樣品預實驗，由于羅庫溴銨原料藥（批號：Z16621702）樣品中汞 (Ηg)、鎘 (Cd)、鈷 (Co)、鉛(Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳 (Ni)、鉻 (Cr)、銅 (Cu)、鋰 (Li)、銻(Sb)元素的濃度均低于定量限，硼(B)元素含量為0.597 mg/kg，接近其定量限，相對標準偏差（RSD）不能很好說明方法精密度，因此，以加標供試品溶液（2.3.4）為對象來考察方法的重復性、進樣精密度和溶液穩定性。

將6份加標供試品溶液依次泵入ICP-MS分析，計算6次測定值的相對標準偏差RSD(%)。結果如表7所示，6份加標供試品溶液中各元素測定結果RSD在2.0%～6.4%之間，表明方法重復性良好。

表7 羅庫溴銨原料藥加標樣品測試重復性 （n=6） mg/kg

2）進樣精密度試驗

將加標供試品溶液（2.3.4）連續泵入ICP-MS分析6次，以6次測定值的相對標準偏差RSD考察方法的進樣精密度。加標供試品溶液中各元素6次測定結果RSD在1.9%～6.3%之間，表明方法進樣精密度良好。

2.5.5 穩定性試驗

以表4為標準曲線工作溶液，將加標供試品溶液在 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h時，分別泵入 ICPMS分析，以6次測定值的相對標準偏差RSD(%)考察方法的穩定性。加標供試品溶液在5 h內各元素6次測定結果的RSD在2.2%～7.7%之間，表明加標供試品溶液在5 h內穩定性良好。

2.5.6 準確度試驗

將6份加標供試品溶液依次泵入ICP-MS分析，計算加標回收率及6次測定結果相對標準偏差RSD(%)以評價回收率一致性。供試品中本底含量采用重復性試驗的平均值（硼含量為0.597 mg·kg-1），汞 (Ηg)、鎘 (Cd)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳 (Ni)、鉻 (Cr)、銅 (Cu)、鋰 (Li)、銻 (Sb)的濃度均低于定量限，故按0計算。6份加標供試品溶液中11 種元素的加標回收率為 86.4%(Ηg)～112.2%(Li)，平均加標回收率為 92.6%(Ηg)～108.2%(Ni)，且回收率的RSD在1.7%(As)～6.7%(Ηg)之間，符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）9101分析方法驗證指導原則中“表2”要求。

2.6 樣品測定

參照上述儀器條件，采用本研究建立的方法對3批羅庫溴銨原料藥中元素雜質進行含量測定，各批次中元素雜質含量均遠小于限度值（均低于限度值的 1%），所測11 個元素雜質無風險。

3 分析與討論

3.1 樣品消解方法和消解體系的選擇

由于干法消解經高溫灼燒，濕法消解在敞口容器中進行，兩種方法會不同程度導致As、Ηg等易揮發元素的損失，造成結果偏低，且耗時較長；微波消解在密閉體系中進行，具有快速、操作簡便、消解徹底等優點，因此本研究選擇微波消解作為樣品預處理方法。以經純化的硝酸來提取待測元素，既能提取完全，又能避免使用鹽酸等試劑給樣品測定帶來干擾。

3.2 試劑空白的影響

CNAS-CL01-A002:2018《檢測和校準實驗室能力認可準則在化學檢測領域的應用說明》6.6.2中強調“特別是痕量分析，應關注試劑空白對檢測結果的影響”。樣品的檢測結果應消除空白造成的影響”。5.9 中要求“高于接受限的試劑空白表示與空白同時分析的這批樣品可能受到污染，檢測結果不能被接受[9]。經對比試驗發現，某品牌硝酸（優級純）經趕酸儀純化后，Al、Cu、Sb、Pb等元素雜質全掃描響 應 值 （ CPS） 分 別 從 3.2×103、 1.8×104、 280、5.0×103降低至 858、1.9×103、20、1.0×103。因此，試劑空白值的大小及其波動將極大影響原料藥中元素雜質含量檢測結果的精密度、穩定性、準確度以及樣品檢測限與定量限，痕量分析試驗中應嚴格控制試劑空白。

3.3 趕酸溫度的確定

Ηg不穩定，易揮發，因此在趕酸時需要注意溫度。經試驗發現，在趕酸溫度為130 ℃，3個空白加標溶液中Ηg的回收率均在95%左右，同條件的6個樣品加標溶液中Ηg的回收率在70%～85%之間，當降低趕酸溫度至120 ℃時，Ηg的回收率介于85%～105%，能夠滿足回收率要求。

3.4 方法的專屬性

《中華人民共和國藥典》（2020年版）指導原則9101中提出：專屬性是指在其他成分存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力；對于雜質檢測，可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質之間能否得到分離。本方法元素選擇的同位素是：7Li、11B、51V、59Co、60Ni、63Cu、75As、111Cd、121Sb、202Ηg、208Pb。11個元素均有各自的同位素，元素之間有效分離；加標樣品溶液與加標濃度的標準溶液中各元素的強度值做對比，基質干擾在15%以內，證明無較強干擾，滿足專屬性要求。

4 結束語

本試驗按照《中華人民共和國藥典》（2020年版）9101分析方法驗證指導原則要求，建立了羅庫溴銨原料藥中11種元素雜質的檢測方法，并進行了方法學驗證。驗證結果表明：供試品溶液對11種元素的基體干擾均低于15%，能滿足專屬性要求；11種元素的方法線性相關系數均大于0.999，且定量限（MQL）均低于羅庫溴銨原料藥中各元素雜質限度要求；精密度試驗、準確度試驗均能滿足《中華人民共和國藥典》（2020年版）要求。采用該方法測定了3批羅庫溴銨原料藥中11 種元素雜質含量，測定結果顯示各目標元素雜質含量均小于其限度值，滿足ICΗ Q3D 中元素雜質限度要求。本試驗建立的測定方法適用于羅庫溴銨原料藥中汞(Ηg)、鎘 (Cd)、鈷 (Co)、鉛 (Pb)、釩 (V)、砷 (As)、鎳(Ni)、鉻 (Cr)、銅 (Cu)、鋰 (Li)、銻 (Sb)、硼 (B)共 11種雜質元素含量的測定。