北京市延慶區牛口蹄疫免疫抗體檢測與防控

王艾晶

北京市延慶區動物疫病預防控制中心，北京延慶 102100

0 引言

牛口蹄疫又稱為“口瘡”，是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、接觸性傳染病，被世界動物衛生組織（WHO）列為法定上報的動物傳染病，我國將其列為重點防范的一類傳染病。口蹄疫病毒易發生變異，目前有7 個血清型：A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3、Aisa I，我國主要流行的是A型、O型和Aisa I型，但在2009年后Aisa I型未見報道[1]。

口蹄疫臨床典型特點是口腔黏膜、蹄部和乳房出現水泡，且水泡中存在大量病毒。口蹄疫潛伏期一般為2～4 天，最長可達7 天，牛體溫突然升高至40～41 ℃，精神不振，食欲減退，流口水，唇內、舌面等處出現水泡，口水漸變成白色泡沫，水泡破裂后變成糜爛組織，嚴重影響奶牛采食、走路和泌乳。犢牛感染口蹄疫后常伴有心肌受損或出血性腸炎，故死亡率較高。

口蹄疫傳播速度快、途徑多、范圍廣，病牛及其分泌物或排泄物或精液都是污染源；通過消化道、皮膚黏膜和呼吸道均能感染該病，嚴重危害了牛群健康，給養殖戶帶來了巨大經濟損失。北京市延慶區是北京市奶牛存欄量較大的區，對北京市奶牛業的發展起到舉足輕重的作用。因此要全面了解和精準掌握該區口蹄疫的發生風險，科學應對口蹄疫免疫和檢測工作中存在的問題，努力采取綜合防控措施為首都奶牛養殖業健康可持續發展保駕護航。

1 延慶區牛口蹄疫免疫狀況

畜禽免疫是有效防控動物疫情，人畜共患病發生的基礎性工作。根據北京市動物免疫計劃，結合延慶區實際情況，實行養殖場程序化免疫，散養戶集中免疫與查漏補針相結合的工作模式，確保應免免疫密度達到100%。程序化免疫由養殖場（戶）自行組織實施，動物疫病預防控制機構做好免疫督導檢查和免疫效果監測評估；對不具備自行免疫能力的散養戶在每年3月、7月、11月開展集中免疫工作，其余時間進行查漏補免，免疫操作由包片獸醫和村級防疫員入村入戶實施完成，努力做到村不漏戶，戶不漏針。目前，延慶區第一次集中免疫工作已圓滿完成。據統計，奶牛存欄6729 頭，其中規模場13 個，存欄6543 頭，散養9 個村，10 戶，存欄186 頭。北京市統一使用的是口蹄疫O-A二價苗，延慶區應免疫6340 頭，實際免疫6340 頭，應免免疫密度為100%。

2 延慶區牛口蹄疫監測狀況

科學評估免疫效果，對口蹄疫的防控有重要意義。延慶區口蹄疫抗體監測包括集中監測、自免場監測、應急監測和跟蹤監測。一般在免疫28 天后開展抗體監測工作，針對不合格的場（戶）要及時分析原因，通知養殖場（戶）做好補免工作。目前，第一次集中免疫工作已圓滿完成，共監測牛口蹄疫樣品1310 份。

3 延慶區牛A/O型口蹄疫檢測方法

3.1 樣品的采集

采用隨機抽樣的方法，對全區13 個奶牛養殖場605 份血樣和10 個散養戶50 份血樣進行采血檢測。采血部位是頸靜脈或尾靜脈，一牛一針，要求每份血樣不少于5 mL且標記清楚，采集完畢立即送達化驗室。規模場采樣不少于存欄量10%，散戶每戶5 份。

3.2 儀器設備

單道和多道移液器，德國Eppendorf公司；酶標儀，伯樂公司。

3.3 試劑盒

口蹄疫O/A型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，蘭州獸研生物科技有限公司。

3.4 檢測方法

3. 4.1 試驗前準備

從冰箱冷藏中取出試劑盒，置于室溫平衡10～30 min；配制磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST）：25 倍的PBST濃縮液用去離子水稀釋成1 倍PBST（1 份濃縮液加入24 份水進行稀釋），用于洗板和血清稀釋；口蹄疫A/O型病毒抗原配制：將試劑盒配備的口蹄疫A/O病毒凍干抗原用1 mL去離子水溶解，溶解后-20 ℃保存，使用時按照工作濃度1:55配制。

分離送檢的655 份奶牛血樣：用普通離心機分離牛血樣，將上層血清倒入深孔板中，封模后，做好標記，4 ℃保存待用。

3.4.2 操作步驟

3.4.2.1 抗原抗體（陰陽對照血清及待檢血清）反應

首先，進行血清稀釋。在酶標板上，以50 μL/孔的量用PBST 2 倍連續稀釋血清，被檢血清在第1-10列從1∶4稀釋至1∶512；在第11列稀釋陽性對照血清，從1∶2稀釋至1∶256；A12-B12孔稀釋陰性對照血清，從1∶2稀釋至1∶4；E12-H12孔為病毒抗原對照孔。

其次，加病毒抗原。將病毒抗原用抗原稀釋液稀釋至工作濃度，以50 μL/孔的量加入到被檢血清、陰陽性對照血清的每一稀釋孔內，4 孔病毒抗原對照孔僅加入100 μL/孔稀釋至工作濃度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，血清的稀釋度加倍，被檢血清從1∶8～1∶1024，由于陽性對照血清已經預先作了8 倍稀釋，則變為1∶2～1∶4096。封板后，輕微振蕩，37 ℃溫育30 min。

3.4.2.2 用PBST連續洗板3 次，拍干，按50 μL/孔加口蹄疫A/O型酶標抗體工作液，封板，37 ℃溫育30 min。

3.4.2.3 用PBST連續洗板3 次，拍干。將TMB底物A溶液和B溶液以1∶1比例混勻，加入混勻后的底物溶液50 μL/孔，置37 ℃顯色15 min。

3.4.2.4 顯色反應結束后，加終止液50 μL/孔，終止反應，在酶標儀上讀取D450nm值，計算結果。

3.4.3 試驗成立條件和結果判定參照試劑盒說明書。

4 結果與分析

抗體檢測結果統計見表1。由表1可知，口蹄疫A型免疫抗體合格率為95.1%，口蹄疫O型免疫抗體合格率為93.5%，結果均超過70%，達到原農業部的部頒標準（GB/T 18935—2018），表明口蹄疫O-A二價苗的免疫效果較好，延慶區奶牛總體處于免疫保護狀態下，發生口蹄疫疫病的風險較低。

表1 牛口蹄疫A/O型抗體ELISA結果

5 討論

全區奶牛口蹄疫抗體監測研究表明：延慶區13 個奶牛規模養殖場的免疫主體責任意識較強，各自均制定了自免程序方案并能按照方案扎實開展奶牛口蹄疫免疫工作，各項操作規范化，管理水平科學化，通過監測結果反饋出口蹄疫發生的風險很低。

延慶區10 個養牛散戶中，9 個養殖戶兩項檢測都合格，僅有1 戶兩項檢測均不合格，該戶發生口蹄疫的風險很大，其免疫抗體效果有待提高。動物疫病監測機構已將結果及時反饋給當地的基層獸醫機構，要求及時補免，適時開展追蹤監測。

通過對養殖戶進行實地走訪發現防疫工作中存在兩方面問題：一是該養牛戶的免疫主體責任意識差，對于免疫工作和監測工作存在抵觸心理。他們認為只要奶牛當下不生病，免疫就無關緊要，加之，免疫時存在過敏反應風險，政府對奶牛流產或死亡的補償資金多年來一直未變，與市場行情有一定差距，所以一旦發生過敏反應，可能會給養牛戶帶來經濟損失，導致養殖戶容易產生拒免心理。另外，在采血監測過程中，可能會加大奶牛應激反應，造成奶牛產奶量下降。有些防疫員采血操作不規范，會對奶牛造成傷害。加之，采樣沒有任何補貼，故養殖戶不能保證一牛一針；二是基層獸醫站冷鏈相關的基礎設施差，疫苗的儲存和運輸不符合要求，如冷藏冰箱又小又舊，防疫員用的冷藏箱使用時間過長，冷藏效果差，降低了疫苗質量，影響了后續的使用效果。

6 防控建議

6.1 加強免疫與檔案管理

對符合免疫的牛只實行強制免疫，要求應免免疫密度達到100%，對新補欄的牛、免疫不合格的牛要及時進行補免，建立免疫屏障，使抗體水平常年維持在較高水平，這是防止口蹄疫疫病發生最有效的手段[2]。

建立健全免疫檔案，嚴格執行登記制度。動物免疫完成后防疫員要及時填寫《北京市動物免疫登記冊》，對病畜、臨產畜、新生畜、過敏畜等要嚴格執行登記制度。存欄數據、免疫數據等基礎性數據設專人建立和規范管理電子、紙質雙重檔案，且必須做到填寫規范、詳細、真實、準確、及時，為后續可能的溯源工作提供有力證據。

6.2 加大檢疫與監測

動物疫病檢疫機構要嚴格遵守檢疫制度，從源頭上遏制不明來源、未經免疫、免疫不合格或來自疫區的奶牛流入市場。對養牛戶新購的奶牛要詳細、準確登記備案，根據相關疫病檢測結果是否合格來出具檢疫證明，一旦出現弄虛作假，按照檢疫法相關規定執行。提倡養殖戶自繁自養，確需引種時，要選擇信譽高的商家，并按照當地規定，及時報備，嚴格隔離，認真觀察，采血檢測，待保證牛只健康后才可混群。

動物疫病預防控制機構要制定全年監測計劃，針對重點區域要加大監測頻次，客觀評價免疫效果，針對不合格的場（戶）及時通知基層單位進行補免，消除疫情隱患。

6.3 嚴格消毒與封閉管理

養殖場進行定期、嚴格的消毒，對消滅傳染源，切斷傳播途徑意義重大。每個養殖場需建立嚴格的消毒制度，設專人定期定時對圈舍、器械、食槽、牛體等進行消毒[3]。消毒藥品種類繁多，常用的有過氧乙酸、聚維酮碘等，為防止不同消毒劑間相互干擾，一般建議使用1～2 種。對圈舍、運動場地等環境的消毒常采用噴灑的方法，可以將奶牛驅趕到空閑處，再無死角全方位消毒，也有采用紫外照射等方法進行消毒滅源。

對奶牛場要進行封閉管理，與生活區分開，牛場外圍要設立高墻、防護網等。外來人員及車輛需進行消毒后，從專門通道進入牛場。免疫人員在進出場前，也要做好鞋帽及器械的消毒工作，嚴禁人為造成交叉感染。

6.4 強化宣傳與培訓

各鄉鎮政府、各動物疫病預防控制機構、各基層機構要采用多種方式、通過多種途徑來宣傳口蹄疫疫病的危害性，強調做好免疫工作的重要性，減輕和消除養殖者對疫病免疫存在的抵觸心理，使他們深刻認識到疫病免疫的不可替代性，配合工作，積極免疫。

在免疫工作開始前，加強對包片獸醫和防疫員的技術指導，確保免疫質量，對免疫結果負責。采取理論與實操相結合的方式進行培訓，內容主要涉及疫苗的配比與保存、注射部位選取、過敏反應救治、血樣采集操作、冷鏈運輸管理、個人防護事項等，以此來提高基層免疫人員的專業水平，增強人身安全。免疫過程中要切實落實“消毒嚴、部位對、劑量準”的操作規范，做到一牛一針，保質保量完成免疫工作。

6.5 提升扶持力度

上級管理部門要設立專項資金，來提高基層獸醫站的基礎設施建設，改善辦公環境，以便順利開展各項工作；提高村級防疫員薪酬水平，調動工作積極性；提高過敏反應補償標準，使養殖戶損失降低到最小。

7 結語

牛口蹄疫具有較高的傳染性，不僅給養牛戶造成巨大的經濟損失，而且對我國養牛業的健康可持續發展產生嚴重影響和不良后果。在日常飼養中要提高對牛口蹄疫疫病的重視，要深刻反省免疫工作中的優點和不足，保持優點，改正不足，扎實做好口蹄疫免疫、監測、檢疫、消毒等一系列綜合防控工作，保證奶牛口蹄疫疫病零發生。