綠茶中三唑磷和茚蟲威農藥殘留的不確定度評定

林 濤，郭 瑾，李夢霞，林 昕，陳 靜，李茂萱，李彥剛，劉宏程*

1. 云南省農業(yè)科學院 質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650205；2. 云南工商管理學院 醫(yī)學院，云南 昆明 650106；3. 云南省農業(yè)科學院 茶葉研究所，云南 昆明 650205

三唑磷和茚蟲威是茶樹種植過程中普遍使用的農藥，主要用于防治茶樹麗綠刺蛾、茶小綠葉蟬和螨蟲等害蟲[1-3]。近年來，隨著茶樹蟲害的日益嚴重，三唑磷和茚蟲威在茶樹上的用量也不斷增大，導致茶葉中的殘留量較大[4-5]。在飲用茶葉時，三唑磷和茚蟲威都會在一定程度上隨著茶葉沖泡過程而遷移到茶湯中并進入到人體內[6-7]，過量的攝入必然會對人體造成一定的傷害。基于此，我國的食品中農藥最大殘留限量標準（GB 2763—2021）[5]對于茚蟲威在茶葉中制定了最大殘留限量要求；雖然沒有對三唑磷進行最大殘留限量規(guī)定，但對于三唑磷的每日允許攝入量（ADI）也規(guī)定了較低的允許值。

為了監(jiān)測綠茶中的三唑磷和茚蟲威殘留量，我國的GB 2763—2021以及相關的文獻也報道了關于三唑磷和茚蟲威的測定方法[8-10]，但是由于綠茶基質成分復雜，在測定過程中常常會出現雜質干擾以及較強的基質效應，嚴重地影響了兩種農藥的準確定量[11-12]，這對于綠茶中三唑磷和茚蟲威的殘留監(jiān)測帶來了較大的困難。

近年來，基體標準物質的出現能夠有效地提高分析過程中的檢測質量，確保檢測方法及數據的可靠性、準確性和可溯源性[13]，但是目前在茶葉中農藥殘留的基體標準物質還比較少，僅有的主要包括了啶蟲脒基體標準樣品[14]、聯苯菊酯基體標準樣品[15]、嘧霉胺等13種農藥多殘留基質標準樣品[16]，對于三唑磷和茚蟲威等農藥的基體標準物質的研究還處于空白。基于此，本試驗研究針對綠茶種植過程中用量較大、檢出率較高的三唑磷和茚蟲威進行基體標準物質的研制，以期為茶葉中農藥殘留檢測與質量安全監(jiān)管提供標準物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樹（小葉種），云南省普洱市；正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇（色譜純），德國Merck公司；乙酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物、檸檬酸鈉二水合物（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；甲酸、乙酸、乙酸銨（色譜純），中國迪馬科技公司；ENVI-Carb SPE固相萃取小柱（6 mL，250 mg），美國 Supelco公司；陶瓷均 質 子、ProElut C18、PSA、GCB 填 料（50μm），中國迪科馬科技公司；三唑磷標準物質（100 μg/mL，GBW(E)082281），壇墨質檢科技股份有限公司；茚蟲威標準物質（10 μg/mL，L14325500CY），Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；三唑磷原藥（PD20050119，有效成分含量85%），安道麥股份有限公司；茚蟲威原藥（PD20170278，有效成分含量97%），江蘇建農植物保護有限公司。

API4000三重四極桿串聯質譜儀，美國AB Sciex公司；1290超高效液相色譜儀，美國Agilent公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.7 μm, 1 mm × 50 mm），美國 Waters公司；7890B氣相色譜儀（配ECD檢測器），美國安捷倫公司；XSR225DU/AC電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；TGL-15B型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；渦旋振蕩器，美國Thermo Scientific公司；HY-5型回旋式振蕩儀，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠茶中三唑磷、茚蟲威陽性基質樣品的制備

在云南省普洱地區(qū)的茶園，選取長勢健康、無明顯病蟲害的適齡茶樹25棵，將三唑磷和茚蟲威原藥用水稀釋為1 mg/L的濃度，混勻后噴施2次，噴施時間分別為采收前20 d和前10 d，其他栽種條件不變。待茶葉到采摘期時分別從每棵茶樹上采摘適量鮮葉，混勻后取5 kg，參照GB/T 14456.1—2017[17]中的加工工藝進行綠茶的制作，制作好的綠茶樣品粉碎過80目分子篩后混勻待分裝。

1.2.2 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標準物質的分裝

將以上粉碎混勻后的綠茶樣品裝入50 mL的HDPE塑料小瓶，每瓶分裝重量為10 g，共分裝150瓶，密封后于室溫下避光保存。

1.2.3 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標準物質的均勻性檢驗

隨機抽取分裝好的基體標樣10瓶，每瓶平行稱取 3 份，每份 2 g，采用 GB 23200.121—2021[18]中規(guī)定的對茶葉的測定方法分別對三唑磷和茚蟲威2種農藥進行測定。測定結果參照GB/T 15000.3—2008（標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法）[19]，以F檢驗，確定綠茶樣品的均勻性數據是否符合正態(tài)分布。

1.2.4 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標準物質的穩(wěn)定性檢驗

短期穩(wěn)定性考察。模擬運輸條件包括常規(guī)和極端的運輸條件，分別考察4℃、20℃和40℃下的穩(wěn)定性，分別在第 0 d、3 d、5 d、7 d、14 d進行穩(wěn)定性考察，每個考察樣品測定5次，取5次結果的平均值，根據GB/T 15000.3—2008[19]采用t-檢驗對檢測結果進行統(tǒng)計分析，相關計算公式如下：

在自由度n-2、置信水平p=0.95（95%顯著水平）下，t- 檢驗的臨界值為：t(0.95,n-2)=t(0.95,3)=3.182；如果 ＜ t(0.95,n-2)s(b1)，則斜率并不顯著，表明檢測樣品在相應的考察周期內穩(wěn)定性較好，反之則說明穩(wěn)定性較差。

短期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻

長期穩(wěn)定性考察。分別于第0個月、1個月、3個月、6個月、12個月取樣檢測。每次取2瓶樣品，每個樣品稱取3份平行樣品，每份試樣以測定5次的平均值為其定值結果。根據GB/T 15000.3—2008[19]，采用t-檢驗進行統(tǒng)計分析，相關的斜率計算公式、截距計算公式、直線上每點的標準偏差計算公式、與斜率相關的不確定度計算公式以及長期穩(wěn)定性的判斷與短期穩(wěn)定性的計算公式相同。長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻ults=12s(b1)。

1.2.5 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標準物質的定值

兩種不同原理測定方法的比較。三唑磷的兩種不同原理測定方法分別采用GB 23200.113—2018[20]和 GB 23200.121—2021[18]并對測定結果進行比較。茚蟲威的兩種不同原理測定方法分別采用SN/T 1971—2007（第一法，氣相色譜法）[21]和GB 23200.121—2021[18]并對測定結果進行比較。

多家實驗室聯合定值。分別選取質檢行業(yè)、農業(yè)檢測行業(yè)、科研機構等不同行業(yè)的代表性相關檢測機構8家，隨機從分裝好的基體標樣中抽取樣品24瓶，每個實驗室分發(fā)3瓶，每瓶稱取1份樣品，按照GB 23200.121—2021[18]方法進行測定，平行測定2次。參照GB/T 15000.3—2008[19]，相關計算公式如下所示。

2 結果與分析

2.1 均勻性

均勻性檢驗結果分別見表1 ～ 表4。從表2和表4可知，三唑磷和茚蟲威的MS間/MS內都小于F0.05（9, 20），說明此次制備的綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標準物質的均勻性較好。

表1 綠茶中三唑磷均勻性檢驗的測量數據Table 1 Measurement data of triazophos homogeneity test in green tea

表2 綠茶中三唑磷均勻性研究的方差分析表Table 2 Analysis of variance table for the study on the homogeneity of triazophos in green tea

表4 綠茶中茚蟲威均勻性研究的方差分析表Table 4 Analysis of variance table for the study on the homogeneity of indoxacarb in green tea

從上表可見，以υ1（即組間）=9及υ2（即組內）=20查 F 界值表，得 F0.05(9, 20)=2.39，由于 F=MS間/MS內=0.615008473 ＜ F0.05（9, 20），所以本樣品是均勻的。

表3 綠茶中茚蟲威均勻性檢驗的測量數據Table 3 Measurement data of indoxacarb homogeneity test in green tea

均勻性檢驗的不確定度ubb=sbb=0.004。

從上表可見，以υ1（即組間）=9及υ2（即組內）=20查F界值表，得F0.05(9, 20)=2.39，由于F= MS間/MS內= 1.879 ＜ F0.05（9, 20），所以本樣品是均勻的。

2.2 穩(wěn)定性

2.2.1 短期穩(wěn)定性

用t-檢驗對數據進行統(tǒng)計分析，試驗結果見表 5。三唑磷和茚蟲威的都小于 t(0.95,nμ2)s(b1)，說明斜率不顯著，表明此綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標準樣品的短期穩(wěn)定性較好。

表5 短期穩(wěn)定性檢驗試驗結果Table 5 Short-term stability test results

2.2.2 長期穩(wěn)定性

用t-檢驗對數據進行統(tǒng)計分析，試驗結果見表 6。三唑磷和茚蟲威的都小于 t(0.95,nμ2)s(b1)，說明斜率不顯著，表明此綠茶基體標準樣品在12個月內穩(wěn)定性較好。

表6 穩(wěn)定性檢驗試驗結果Table 6 Test Results of stability check

2.3 定值結果

2.3.1 不同原理方法的測定結果比較

根據相關的國家標準中對于三唑磷和茚蟲威的測定方法，不同測定方法的結果如表7所示。結果表明，不同原理的測定方法對于綠茶中的三唑磷和茚蟲威的相對相差較小，標準中的相關方法都可以使用，但為了在實際檢測工作中快速便捷，推薦該基體標準物質中的三唑磷和茚蟲威采用GB 23200.121—2021中的LC-MS/MS方法進行測定。

表7 兩種測定方法比較Table 7 Comparison of the two determination methods

2.3.2 定值結果

三唑磷和茚蟲威的多家實驗室聯合定值結果及相關計算分別見表8和表9。

表8 三唑磷聯合定值結果Table 8 Results of joint determination of triazophos

表9 茚蟲威聯合定值結果Table 9 Results of joint determination of indoxacarb

2.3.3 不確定度計算

根據GB/T 15000.3—2008的規(guī)定，定值結果由特性值和不確定度組成。根據本次綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標準物質的研制過程，其不確定度uCRM由標準值定值試驗產生的不確定度天平稱量產生的不確定度u1（使用的電子天平分辨率為0.00001 g，它的最大允許誤差為0.00010 g，按均勻分布，故儀器產生的不確定度、均勻性檢驗的不確定度ubb、短期穩(wěn)定性檢驗的不確定度usts和長期穩(wěn)定性檢驗的不確定度ults組成，如表10所示。

表10 綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標準物質特性值Table 10 Characteristic values of matrix reference material of triazophos and indoxacarb in green tea

3 結論

本實驗采用在茶樹上噴灑三唑磷和茚蟲威農藥制備得到陽性樣品，并按照綠茶加工工藝制備得到成品茶后進一步粉碎、過篩、分裝后得到綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標準物質。均勻性和穩(wěn)定性檢驗表明該基體標準物質的均勻性較好，且12個月內較穩(wěn)定。通過多家實驗室聯合定值結果為：三唑磷0.317±0.027 mg/kg、茚蟲威 0.572±0.029 mg/kg。