基于高通量測序的昭通核心煙區植煙土壤細菌多樣性分析

劉永軍， 倪 霞*， 陸文林， 龔 林， 陳 華， 高順波， 盤文政，李德文， 陳 敏， 夏 蕾， 朱永立， 林先亮， 普曉明

(1.云南省煙草公司 昭通市公司， 云南 昭通 657000； 2.云南云葉化肥股份有限公司， 云南 昆明 650217； 3.云南省昭通市植保植檢站， 云南 昭通 657000)

0 引言

【研究意義】煙草(Nicotianatabaccum)是云南的主要經濟作物之一，煙草生長發育離不開土壤，土壤為煙株生長發育提供充足養分，不合理的耕作方式影響植煙土壤微生物多樣性，導致土地可持續生產能力下降[1-2]。土壤中微生物能提高土壤肥力，促進土壤有機質分解，加快養分循環轉化，抑制土傳病蟲害傳播等[3-4]。其中，土壤細菌作為土壤微生物中種類和數量最多的類群，其多樣性一定程度上反映土壤功能的多樣性，土壤細菌多樣性通過影響植物營養吸收進而影響其生長發育[5-6]。因此，探明昭通核心煙區植煙土壤中的細菌多樣性有利于土壤細菌資源的開發利用，還能為昭通核心煙區烤煙種植提供參考?！厩叭搜芯窟M展】目前，對植煙土壤微生物多樣性已有較多研究，陳堯等[5]采用平板培養方法對不同施肥方式下烤煙根際微生物進行研究表明，解磷菌、解鉀菌和固氮菌數量在不同施肥方式中有變化，為科學選擇施肥方式提供理論依據；何川等[7]采用BIOLOG生態平板法，探究煙草連作對土壤微生物多樣性的影響得出，煙草連作年限超過3年，其土壤微生物多樣性顯著降低；賈志紅等[8]利用PCR-DGGE法對云南玉溪煙區輪作與連作植煙土壤細菌多樣性進行分析表明，輪作土壤細菌多樣性較連作高，且輪作可以提高土壤細菌群落多樣性；王飛等[9]應用高通量測序技術研究不同綠肥對植煙土壤細菌群落結構的影響發現，翻壓黑麥草處理對細菌種分類水平影響最大，翻壓綠肥可以改善土壤細菌群落結構；楊帥等[10]利用Illumina HiSep高通量測序研究不同輪作方式對煙田土壤細菌多樣性的影響發現，煙草-青蒿輪作能顯著降低煙草黑脛病的發病率，而煙草-田菁輪作會提高煙草青枯病的發病率；齊虹凌等[11]應用454焦磷酸測序技術分析連作和輪作條件下煙株不同生育期根際土壤細菌多樣性的差異發現，煙株生育期是影響煙株根際土壤細菌結構的主要因素，輪作和連作不是影響煙株根際土壤細菌結構的主要因素，但輪作能提高土壤細菌的多樣性。【研究切入點】微生物多樣性擴增子測序是一種利用高通量測序技術對16S、18S、ITS等微生物特征序列進行PCR擴增并測序分析的研究方法。其中，16S rDNA(即16S rRNA gene)是原核生物核糖體RNA對應的基因片段，常用于細菌、古細菌的多樣性分析。此類方法不需要對微生物進行分離純化培養，基于提取的總DNA即可開展豐富的微生物群落研究，在醫學、工業、食品、環境科學等各領域應用廣泛。良好的土壤細菌結構和較高的土壤細菌多樣性能改善土壤理化性質，提高土壤肥力。煙草是云南昭通主要的經濟作物，尚未見分析其土壤細菌多樣性的報道?！緮M解決的關鍵問題】基于高通量測序平臺，從分子水平探究昭通8個種煙縣(區)的新煙區、土傳病害發病嚴重的連作區以及典型的輪作區的土壤細菌多樣性，以期了解昭通核心煙區各耕作方式下土壤細菌的多樣性，為改善昭通核心煙區土壤肥力，提高耕地可持續生產能力及煙葉質量提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤樣品

供試土壤樣品采集于昭通8個種煙縣(區)的新煙區、土傳病害(“兩黑”病、青枯病和根結線蟲病等)發病嚴重的連作區以及典型的輪作區(表 1)，合計388個土壤樣品。

表1 供試土壤樣品

1.2 試驗設計

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode(測序接頭)的特異引物擴增rDNA的保守區，V3～V4的引物序列，341F，CCTACGGGNGGCWGCAG；806R，GGACTACHVGGGTATCTAAT，全長466 bp。然后PCR擴增產物切膠回收，使用Qubit 3.0進行產物定量。擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，測序策略PE250在Illumina上機測序。

1.3 信息分析流程

測序得到raw Reads之后，先對低質量Reads進行過濾，然后將雙端Reads拼接為Tag，再對Tag進行低質量過濾，得到的數據稱為Clean Tag?；贑lean Tag，使用Usearch進行聚類，去除聚類過程中檢測到的嵌合體Tag，獲得OTU的豐度和OTU代表序列。

若存在有效分組，則進行組間差異比較和統計檢驗。最后，結合其他因素(如環境因子)進行特定的如CCA等高級分析，以解答微生物與環境之間的關系。

1.4 數據處理

將新煙區、連作區和輪作區的植煙土壤樣本分別設為A組、B組和E組。根據試驗需要，利用Wilcoxon秩和檢驗模型對不同類型土壤的細菌類群的相對豐度進行比較，明確細菌物種豐度在不同類型土壤中是否有顯著差異。Sobs、Chao及ACE指數主要體現樣本的物種豐富程度，值越大物種豐富程度越高；香濃指數和辛普森指數主要反映物種分布的均勻度，數值越大越均勻；香濃指數值越大，多樣性越高。

2 結果與分析

2.1 昭通核心煙區土壤細菌群落組成

根據OTUs的分類關系，昭通核心煙區土壤細菌群落包括44個門、138個綱、332個目、486個科和1 044個屬。

2.1.1 門水平 由圖1可知，水平相對豐度排前10位的細菌群落門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、髕骨細菌門(Patescibacteria)和裝甲菌門(Armatimonadetes)。其中，綠彎菌門和髕骨細菌門在新煙區土壤細菌群落中相對豐度較高，放線菌門在連作區土壤細菌群落中相對豐度較高，變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、擬桿菌門和裝甲菌門在輪作區土壤細菌群落中相對豐度較高。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為昭通核心煙區土壤細菌群落的優勢門，4個門的序列占全部序列的68.19%～73.15%。新煙區、連作區和輪作區的土壤細菌群落最優勢類群均為變形菌門，新煙區和連作區次優勢類群均為放線菌門，輪作區次優勢類群為酸桿菌門。

圖1 3個煙區門水平上細菌類群的組成及相對豐度

2.1.2 屬水平 由圖2可知，屬水平相對豐度前10位的分別為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、Chujaibacter、鏈霉菌屬(Streptomyces)、MND1、Bryobacter、RB41、Candidatus_Solibacter、Candidatus_Udaeobacter和Ellin6067。在新煙區土壤中，芽單胞菌屬、Chujaibacter、Bryobacter和Candidatus_Solibacter相對豐度較高；在連作區土壤中，鏈霉菌屬和Ellin6067相對豐度較高；在輪作區土壤中，鞘氨醇單胞菌屬、ND1、RB41和Candidatus_Udaeobacter相對豐度較高。因此，昭通核心煙區土壤的最優勢細菌類群為鞘氨醇單胞菌屬，占所有序列的4.44%～6.58%。在新煙區土壤中，細菌群落相對豐度前3位的屬分別為鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Chujaibacter；在連作區土壤中，相對豐度前3位的屬分別為鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和鏈霉菌屬；在輪作區土壤中，相對豐度前3位的屬分別為鞘氨醇單胞菌屬、RB41和芽單胞菌屬。

圖2 3個煙區屬水平上細菌類群的組成及相對豐度

2.2 昭通核心煙區土壤細菌群落指示物種

2.2.1 優勢物種 由圖3可知，在門水平，放線菌門、綠灣菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、擬桿菌門和髕骨細菌門等6個門的相對豐度在新煙區與連作區土壤細菌群落間均存在顯著差異，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、擬桿菌門和髕骨細菌門等9個門的相對豐度在新煙區與輪作區土壤細菌群落間均存在顯著差異，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門和髕骨細菌門等6個門的相對豐度在連作區與輪作區土壤細菌群落間均存在顯著差異。新煙區土壤中綠灣菌門的相對豐度顯著高于連作區和輪作區，芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著低于連作區和輪作區；連作區土壤中放線菌門的相對豐度顯著高于新煙區和輪作區；輪作區土壤中變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門和疣微菌門的相對豐度顯著高于新煙區和連作區。

圖3 在門水平上細菌群落相對豐度的Wilcoxon秩和檢驗

由圖4可知，在屬水平，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、鏈霉菌屬、MND1、Bryobacter、RB41、Candidatus_Solibacter和Ellin6067等8個屬的相對豐度在新煙區與連作區土壤細菌群落之間均存在顯著差異，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Chujaibacter、鏈霉菌屬、MND1、Bryobacter、RB41、Candidatus_Solibacter和Candidatus_Udaeobacter等9個屬的相對豐度在新煙區與輪作區土壤細菌群落之間均存在顯著差異，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Chujaibacter、鏈霉菌屬、MND1、RB41、Candidatus_Solibacter、Candidatus_Udaeobacter和Ellin6067等9個屬的相對豐度在連作區與輪作區土壤細菌群落之間均存在顯著差異。新煙區土壤中鞘氨醇單胞菌屬、MND1和RB41的相對豐度顯著低于連作區和輪作區，芽單胞菌屬、Bryobacter和Candidatus_Solibacter的相對豐度顯著高于連作區和輪作區；連作區土壤中Ellin6067的相對豐度顯著高于新煙區和輪作區；輪作區土壤中Chujaibacter和鏈霉菌屬的相對豐度顯著低于新煙區和連作區，Candidatus_Udaeobacter的相對豐度顯著高于新煙區和連作區。

圖4 在屬水平上細菌群落相對豐度的Wilcoxon秩及檢驗

2.2.2 特有物種 由圖5和表2可知，新煙區土壤細菌群落有2個特有綱、7個特有目、11個特有科和29個特有屬，連作區有3個特有門、5個特有綱、11個特有目、19個特有科和53個特有屬，輪作區有1個特有門、3個特有綱、6個特有目、8個特有科和13個特有屬。連作區土壤細菌群落特有物種多于新煙區和輪作區。

注：a～e分別為門、綱、目、科及屬水平物種VENN圖。

表2 昭通核心煙區不同類型土壤的細菌群落特有物種

2.2.3 指示物種 從圖6看出，新煙區、連作區和輪作區的土壤細菌群落有重疊部分，但有部分樣本點相互的距離較遠，且X軸(32.09%)與Y軸(14.10%)累計貢獻量達46.19%，說明不同類型土壤的細菌群落結構組成有一定差異。

圖6 昭通核心煙區3種類型土壤細菌群落組間比較

根據分類學組成對新煙區、連作區和輪作區土壤進行線性判別分析(LDA)，找出對不同類型土壤產生顯著性差異影響的群落，僅LDA得分值大于4的被展示(圖7)。新煙區土壤細菌群落中差異指示物種為嗜酸桿菌綱、酸桿菌目、Frankiales目、纖線桿菌(從綱到科)和羅丹諾桿菌科，連作區差異指示物種為放線菌綱和嗜熱油菌綱，輪作區差異指示物種為Pyrinomonadaceae(從目到科)、鞘氨醇單胞菌(從目到屬)、δ-變形菌綱、β-變形菌目。以上物種對昭通核心煙區新煙區、連作區和輪作區土壤間細菌群落結構組成的差異起重要作用。

圖7 昭通核心煙區3種不同類型土壤細菌群落的特殊群落及影響力

2.3 昭通核心煙區土壤細菌群落生物多樣性

從表3可見，昭通核心煙區土壤細菌群落的Sobs指數、Chao指數、ACE指數和香濃指數均以輪作區最高，連作區次之，新煙區最低；辛普森指數以輪作區最高，新煙區次之，連作區最低。由圖8可見，輪作區的Sobs指數、Chao指數、ACE指數、香濃指數和辛普森指數與連作區均有極顯著差異，Sobs指數、Chao指數、ACE指數和香濃指數與新煙區均有極顯著差異，辛普森指數與新煙區有顯著差異；連作區的Sobs指數與新煙區有顯著差異，Chao指數、ACE指數、香濃指數和辛普森指數與新煙區差異不顯著。生物多樣性是指特定生境或生態系統內的多樣性情況，通常利用物種豐富度(種類情況)與物種均勻度(分布情況)2個重要參數判定。可見，輪作區土壤細菌群落的生物多樣性最高；連作區土壤細菌群落的物種豐富度高于新煙區，物種均勻度與新煙區相當；連作區細菌群落生物多樣性略高于新煙區。

表3 昭通核心煙區3種不同類型土壤細菌群落的生物多樣性指數

圖8 昭通核心煙區3種不同類型土壤細菌群落的生物多樣性指數

由圖9可知，3種不同類型土壤細菌的稀釋曲線均趨于平緩，說明基于研究的測序深度，土壤中包括稀有物種在內的所有細菌均已分析，真實地反映了該研究區的細菌群落組成。

圖9 昭通核心煙區3種不同類型土壤細菌的稀釋曲線

2.4 昭通核心煙區土壤細菌群落的PICRUSt功能

從表4可見，昭通核心煙區土壤細菌群落Pathway level 1有6條代謝通路，Pathway level 2有35條代謝通路。在生態環境類似的條件下，新煙區、連作區和輪作區土壤細菌群落代謝通路相似，但代謝通路的豐度值不同。如圖10 所示，除外源生物降解與代謝、細胞運動性和信號傳導相關代謝通路的豐度值新煙區和連作區差別較小外，其余代謝通路的豐度值以連作區最高，新煙區次之，輪作區最低。如圖11所示，豐度值排列的代謝通路中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、萜類和聚酮類代謝、其他氨基酸的代謝、脂類代謝、外源生物降解與代謝、能量代謝、復制和修復以及折疊、定位和降解等通路的豐度值在新煙區與連作區間、新煙區與輪作區間、連作區與輪作區間均存在顯著差異。整體看，土壤細菌群落代謝通路的豐度值連作區最高，新煙區次之，輪作區最低，表明土壤細菌群落代謝功能潛力連作區最高，新煙區次之，輪作區最低。

表4 昭通核心煙區3種不同類型土壤的細菌群落功能分布

圖 10 昭通核心煙區3種不同類型土壤的細菌群落功能豐度熱圖

圖11 細菌群落代謝通路豐度值的Wilcoxon秩及檢驗

3 討論

高通量測序技術可對幾百萬個DNA分子進行有效的序列測定，能夠客觀真實地反映環境微生物群落結構特征[12]，被廣泛應用于環境樣品微生物群落組成的分析研究[13-14]，其研究手段不依賴于傳統的微生物分離培養，而是直接從環境中獲取基因信息，其測序結果可以包含大多數弱勢種群，可以更全面地反映微生物多樣性的真實水平[15-16]。微生物多樣性研究主要分為alpha、beta多樣性研究、物種分析、功能研究、環境關系研究。本研究應用高通量測序技術對昭通核心煙區土壤細菌群落結構進行分析表明，昭通核心煙區土壤細菌菌群極其豐富，包括44個門、138個綱、332個目、486個科和1 044個屬。細菌群落門水平相對豐度前10位的分別為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、疣微菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門和裝甲菌門，其中，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為昭通核心煙區土壤細菌群落的優勢門，這4個門的序列占所有序列的68.19%～73.15%，其相對豐度因土壤類型而異，與前人研究結果[17-20]一致。屬水平相對豐度前10位的分別為鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Chujaibacter、鏈霉菌屬、MND1、Bryobacter、RB41、Candidatus_Solibacter、Candidatus_Udaeobacter和Ellin6067，其中，鞘氨醇單胞菌屬為昭通核心煙區土壤細菌群落的最優勢屬，占所有序列的4.44%～6.58%，其相對豐度因土壤類型而異。同時，在3類土壤樣品中，Unclassified bacteria占有一定比例，說明在昭通核心煙區土壤中仍存在大量未知和稀有的細菌[21]。

不同類型土壤的細菌群落結構有一定差異[22]。本研究中，3類土壤細菌群落最優勢門均為變形菌門，新煙區和連作區次優勢門均為放線菌門，輪作區次優勢門為酸桿菌門；新煙區土壤細菌群落芽單胞菌屬的相對豐度顯著高于連作區和輪作區，連作區鏈霉菌屬的相對豐度顯著高于新煙區和輪作區，輪作區鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度顯著高于新煙區和連作區。因為連作導致土壤理化性質惡化、養分失調以及微生物區系發生變化[23]，可使土壤中鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬等有益菌數量減少，從而破壞微生物群落平衡，導致土壤連作障礙的發生[24]。

輪作能提高植煙土壤細菌生物多樣性[8，18]。本研究基于種的分類水平對新煙區、連作區和輪作區土壤細菌群落多樣性指數進行分析表明，輪作區土壤細菌群落的生物多樣性最高；連作區土壤細菌群落的物種豐富度略高于新煙區，物種均勻度與新煙區相當，其細菌群落生物多樣性略高于新煙區。前人研究表明，連作使植煙土壤細菌種類減少，群落結構趨于簡單，可能是由于連作種植單一或存在連作障礙因子等，限制了土壤某些細菌的生長[25]，同時刺激了其他種類細菌的生長而促使其成為優勢種類，使得土壤細菌種類較少[26]。土壤微生物群落數量及結構的變化直接影響著根際微生物整體功能，一般來說，多樣性指數較高，系統的結構也較復雜，穩定性相對較高[27]。經對昭通核心煙區土壤細菌群落進行功能預測表明，在生態環境類似的條件下，新煙區、連作區和輪作區土壤細菌群落代謝通路相似，但代謝通路的豐度值不同，以連作區土壤細菌群落代謝通路的豐度值最高，新煙區次之，輪作區最低。

4 結論

昭通核心煙區土壤細菌群落組成具有多樣性，輪作區土壤細菌群落的生物多樣性最高，連作區土壤細菌群落生物多樣性略高于新煙區。輪作區、連作區和新煙區的土壤細菌優勢門均為變形菌門，優勢屬均為鞘氨醇單胞菌屬。不同類型土壤的細菌群落結構組成有一定差異，連作區土壤細菌群落特有物種多于新煙區和輪作區。在生態環境類似的條件下，新煙區、連作區和輪作區土壤細菌群落代謝通路相似，但是代謝通路的豐度值不同，連作區植煙土壤細菌群落代謝功能潛力最高。