丁香酚對2型糖尿病小鼠的降血糖作用及肝臟糖脂代謝信號轉導通路調控

張金山，金國范，劉 艷，張立會，權海燕

(1.延邊大學附屬醫院中心實驗室，2.延吉市依蘭鎮中心衛生院藥局，吉林 延吉 133000)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種由胰島素分泌缺陷及(或)胰島素抵抗引起的以高血糖為特征的慢性、全身性代謝性疾病，臨床分型主要為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)，其中T2DM占90%～95%。據國際糖尿病聯合會最新發布的全球糖尿病地圖顯示, 2019年全球糖尿病患病率約為9.3%(4.63億人)，預計到2030年將增加25%升至10.2%(5.78億人)，到2045年將增加51%升至10.9%(7億人)，其中50.1%的糖尿病患者未知自己患有糖尿病[1]。已知，T2DM與遺傳因素、自身免疫以及腸道菌群等密切相關，但其病因及發病機制仍未完全闡明。此外，T2DM患病人群年輕化及其并發癥導致的高死亡率使其已然成為危害公眾健康的嚴重疾病之一[2]，因此，尋找能夠改善T2DM的藥物也成了研究的熱點。

肝臟作為調控機體糖脂代謝平衡的重要器官，是胰島素調控血糖平衡的主要靶器官之一，在胰島素抵抗的發生發展中起重要作用。研究發現，機體內糖脂代謝及胰島素穩態受眾多共同信號通路以及交錯形成的復雜網絡的調控[3]。肝臟脂肪變性導致胰島素抵抗，使外周組織和靶器官對葡萄糖的利用障礙，導致血糖水平升高。因此，通過調控肝臟糖脂代謝紊亂可抑制胰島素抵抗，進而改善T2DM。

丁香酚(eugenol)是丁香揮發油的主要揮發性成分，存在于丁香、肉桂、羅勒、肉豆蔻等芳香植物種。目前，有報道稱丁香酚具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗癌等多種藥理活性[4-5]。其中，丁香酚對炎癥和氧化應激的實驗研究相對較多，但是其對T2DM及肝臟糖脂代謝等代謝性疾病的藥理作用尚不清楚。本研究以高脂飼料誘導C57BL/6小鼠的T2DM模型為實驗對象，探討丁香酚能否改善T2DM及肝臟糖脂代謝紊亂及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5周齡的SPF級C57BL/6雄性小鼠通過延邊大學購買，許可證號SCXK(遼)2015-0001，飼養條件為(22±2)℃、濕度(50±5)%，12 h/12 h光照黑暗循環，自由攝食飲水，適應環境1周后進行實驗。

1.2 藥物、試劑及實驗儀器丁香酚、二甲雙胍、蘇木素染液(sigma公司)。抗體SHP、pFOXO1、pCREB、PEPCK、G6Pase購自Cell Signaling Technology；內參actin購自Santa Cruz Biotechnology；血糖(plasma glucose, PG)、胰島素(insulin, RI)、甘油三酯(triglyceride, TG)、膽固醇(cholesterol, CT)、丙氨酸轉氨酶(aspartate transaminase, ALT)、天冬氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase, AST)、抵抗素(resistin, RP)、瘦素(leptin, LP)、胃饑餓素(ghrelin, GHRP)、胰高血糖素(glucagon, GC)、血漿纖溶酶原激活抑制劑-1(Plasma plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)試劑盒購自Stanbio Laboratory；蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶公司。臺式離心機(美國Beckman Coulter公司)；凝膠成像儀(美國protein Simple公司)；顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1高脂飼料誘導小鼠2型糖尿病模型的建立、分組及給藥 C57BL/6小鼠高脂飼料飼養, 試驗飼料的成分(Tab 1)。以上述飼料飼養8周后，尾尖采血測定空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，選取11.1 mmol·L-1≤FBG≤33.3 mmol·L-1者納入實驗。小鼠分為普通飼料組(RD)、高脂飼料組(HFD)、丁香酚給藥組(40 mg·kg-1·d-1)及二甲雙胍給藥組(200 mg·kg-1·d-1)，RD組及HFD組給予等量蒸餾水。以上各組均為灌胃給藥，每周測定1次血糖和體質量，連續給藥6周。6周后，采血分離血清待測，取出肝臟組織稱質量、-80 ℃保存，部分用4%多聚甲醛固定。

Tab 1 Composition of experimental diets

1.3.2肝指數測定 取各組小鼠肝臟，稱質量并計算肝指數，肝指數=肝質量/體質量。肝組織中脂質含量、TC、AST、ALT是利用試劑盒(Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA)和全自動分析儀(SMARTLAB, Mannheim, Germany)檢測。

1.3.3口服糖耐量試驗(OGTT)測定 給藥6周后測OGTT，小鼠禁食不禁水12 h后，測定0 h血糖，然后灌胃葡萄糖溶液(2 g·kg-1)，分別在30、60、90、120 min測量血糖。計算葡萄糖曲線下面積(arae under curve,AUC)。AUC=1/4×FBG值+1/2×0.5 h血糖值+3/4×1 h血糖值+1/2×2 h血糖值。

1.3.4生化指標 血清中PG、RI、TG、TC、RP、LP、GHRP、GC、PAI-1是利用試劑盒(Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA)和全自動分析儀(SMARTLAB, Mannheim, Germany)檢測。

1.3.5肝臟組織HE染色 肝組織用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色、二甲苯透明，做形態學觀察。

1.3.6Western blot檢測 采用RIPA裂解液提取小鼠肝臟組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，調等濃度后，加上樣緩沖液使蛋白變性。80 V恒壓電泳30 min，轉100 V恒壓電泳1 h，100 V恒壓轉膜120 min，用5% BSA溶液封閉90 min,加入一抗SHP(1 ∶1 000)、pFOXO1(1 ∶1 000)、pCREB(1 ∶1 000)、PEPCK(1 ∶1 000)、G6Pase(1 ∶1 000)和內參β-actin(1 ∶2 500)4 ℃孵育過夜，洗膜3次，10 min/次，加入二抗HRP(1 ∶5 000)孵育90 min, 再次洗膜后在顯影成像儀中顯色曝光，條帶用Image Lab 6.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 丁香酚對T2DM小鼠體重及肝臟的影響與RD組相比，HFD組小鼠體質量明顯增加(P<0.01)，形態明顯臃腫，肝臟體積增大，脂肪變性，表面呈淡紅色。與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠體質量降低差異無統計學意義，肝臟體積減小，顏色接近于健康的暗紅色，見Fig 1。

2.2 丁香酚對T2DM小鼠肝指數、脂代謝及肝功能的影響與RD組相比，HFD組小鼠肝質量、肝指數、脂質含量、肝甘油三酯、ALT、AST升高2.3倍、1.3倍、3.2倍、1.5倍、6.2倍、7.8倍；與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠肝質量降低41.2%和18.37%、肝指數降低35.4%和12.3%、脂質含量降低52.9%和28.9%、肝甘油三酯53.4%和46.2%、AST降低69.8%和47.2%、ALT降低47.1%和37.2%，見Fig 2。

2.3 丁香酚對T2DM小鼠OGTT的影OG-TT結果顯示，各組小鼠血糖值在30 min時間點到達頂峰后逐漸降低。與RD組比較，HFD組小鼠不同時間點的血糖值均明顯升高(P<0.01)；與HFD組比較，MET200組小鼠在不同時間點的血糖值均降低(P<0.05)，而E40組小鼠在120 min時間點的血糖值差異無統計學意義。根據AUC表明，與RD組相比，HFD組小鼠AUC增加1.8倍；與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠AUC降低26.6%和12.7%，見Fig 3。

Fig 1 Effects of eugenol on body weight and liver

##P<0.01 vs RD group.

2.4 丁香酚對T2DM小鼠血清各項指標的影響與RD組相比，HFD組小鼠血清中血糖、膽固醇、抵抗素、瘦素、胰高血糖素、纖溶酶原激活物抑制劑-1水平分別升高1.9倍、1.8倍、2.4倍、33.1倍、3.6倍、2.1倍，胃饑餓素降低2.5倍，其中胰島素水平明顯升高(P<0.01)。與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠血清中血糖降低16.6%和24.6%、胰島素降低83.0%和68.9%、瘦素降低25.7%和28.9%、胰高血糖素降低27.8%和54.5%、纖溶酶原激活物抑制劑-1水平降低24.3%和57.0%。與MET200組相比，E40組小鼠血清中抵抗素、胰高血糖素、纖溶酶原激活物抑制劑-1水平降低，見Fig 4。

2.5 丁香酚對T2DM小鼠肝組織病理學改變的影響HE染色結果顯示，RD組小鼠肝細胞大小均一、排列整齊、無細胞壞死與脂肪變性；HFD組小鼠肝細胞明顯腫脹、脂肪變性、胞質內可見脂滴空泡。

Fig 2 Effects of eugenol on liver index, lipid metabolism and liver function of mice

Fig 3 Effect of eugenol on OGTT in mice

與HFD組比較，MET200組和E40組小鼠細胞排列整齊，肝細胞脂肪變性及炎癥浸潤減輕，見Fig 5。

2.6 丁香酚對T2DM病小鼠肝組織中SHP/pFOXO1/pCREB/PEPCK/G6Pase信號通路相關蛋白表達的影響Western blot結果示，與RD組相比，HFD組小鼠肝組織中SHP蛋白表達下調(P<0.05)，PEPCK、G6Pase蛋白表達明顯上調(P<0.01)。與HFD組相比，MET200組和E40組SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達上調(P<0.05)，PEPCK、G6Pase蛋白表達明顯下調(P<0.01)。與MET200組相比，E40組小鼠肝組織中SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達上調，見Fig 6。

3 討論

近年來，人們對T2DM的病因及發病機制有了深入的研究，有報道稱β細胞功能障礙和胰島素抵抗[6]、外周組織和靶器官對葡萄糖的利用障礙[7]、脂質代謝紊亂[8]、氧化應激、炎癥反應[9]以及腸道菌群失調[10]等與T2DM的發生發展密切相關。因此，尋找和研究能夠改善上述病因及發病機制的中草藥已成為研究熱點，其中，丁香酚以其所特有的抗炎、抗氧化作用而備受關注。有研究表明，丁香酚通過調節GLUT4/AMPK信號通路，增強胰島素敏感性和外周組織和靶器官對葡萄糖的利用、抑制氧化應激與炎癥反應進而延緩T2DM的發展進程[11]。另有實驗研究指出，丁香酚通過調控肝功能標記酶和PEPCK、G6Pase等糖代謝關鍵酶活性，降低T2DM大鼠的體質量和肝糖原含量，提高血漿胰島素水平，從而改善T2DM[12]。本研究結果提示，丁香酚在降低T2DM血糖水平及肝臟糖脂代謝紊亂方面具有一定的療效作用。

Fig 4 Effect of eugenol on various indexes in mouse serum

1：RD； 2：HFD； 3：HFD+MET200； 4：HFD-E40.##P<0.01vsRD group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

Fig 5 The histopathological changes of mouse liver (HE，100×)

Fig 6 Effects of eugenol on expression of SHP, pFOXO1, pCREB, PEPCK and G6Pase in mouse liver

#P<0.05,##P<0.01vsRD group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group.

2002年，McGarry在美國糖尿病協會上提出了“糖尿病是糖脂病”, 這一概念的提出使人們對T2DM發病機制的認識逐漸從早期的胰素抵抗/血糖中心論逐漸轉向脂質代謝紊亂為中心[13]。肝臟作為機體重要的能量代謝器官，其糖原合成和糖異生在糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗中起重要作用，因此，調控肝臟糖脂代謝可以改善T2DM[14]。本研究結果顯示，與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠體重降低，肝臟體積減小且呈現健康的暗紅色。MET200組和E40組較HFD組肝指數、肝臟脂質代謝及肝功能指標降低。OGTT試驗顯示，MET200組和E40組較HFD組葡萄糖耐量增強，曲線下面積顯著降低，胰島β細胞功能正常。相較于HFD組，MET200組和E40組血清中血糖、胰島素、甘油三酯、抵抗素、瘦素、胰高血糖素以及纖溶酶原激活物抑制劑-1水平降低。HE染色顯示，HFD組肝細胞明顯增大并伴有大泡性脂肪變性，MET200組和E40組明顯改善肝細胞脂肪變性及肝臟病理狀態。此外，與MET200組相比，E40組小鼠血清中血糖、抵抗素、胰高血糖素、纖溶酶原激活物抑制劑-1降低水平及肝細胞脂肪變性改善更加明顯。上述研究結果顯示，丁香酚可以降低小鼠體重及肝指數、調節肝臟糖脂代謝紊亂、改善肝功能和肝細胞脂肪變性、抑制胰島素抵抗進而改善T2DM。

小異二聚體伴侶(small heterodimer partner, SHP)是核激素受體超家族的孤核成員，是一種關鍵的代謝傳感器，其作為一種轉錄共抑制因子與多種核受體及轉錄因子相互作用形成調節網絡，參與調節肝臟糖質代謝、胰島素抵抗和β細胞功能障礙，與肥胖和T2DM切相關[15]。SHP的下游靶標叉形頭轉錄因子1(forkhead transcription factor 1, FOXO1)和環磷腺苷反應元件結合蛋白B(cAMP-response element binding protein, CREB)分別在氧化應激和胰島素抵抗、肝臟糖異生和脂質代謝中起關鍵作用[16]。在肝臟中，活化的SHP通過直接磷酸化其下游靶標FOXO1和CREB[17]，進而調節磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)等糖異生關鍵酶的蛋白表達[18]。與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠肝組織中SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達上調，PEPCK、G6Pase蛋白表達明顯下調。與MET200組相比，E40組小鼠肝組織中SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達明顯增加。本研究結果顯示，丁香酚能夠明顯活化SHP，激活其下游靶點FOXO1和CREB的磷酸化，抑制PEPCK、G6Pase的表達，從而調控肝臟糖脂代謝紊亂和抑制胰島素抵抗，改善T2DM。

綜上所述，丁香酚可能通過上調SHP的蛋白表達、FOXO1與CREB的磷酸化，下調PEPCK和G6Pase的蛋白表達來調控肝臟糖脂代謝和抑制胰島素抵抗，降低血糖水平，進而為T2DM及肝臟糖脂代謝紊亂等代謝性疾病開辟新的潛在的治療途徑。