高效液相色譜串聯(lián)質譜法快速檢測腎移植患者泊沙康唑血藥濃度*

林冠麗 ，楊佳彬 ，尹 威 ，張其愛 ，曾彩芳 △

（1. 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 510210； 2. 廣州醫(yī)科大學，廣東 廣州 511495）

泊沙康唑屬第2代三唑類抗真菌藥物，相較于三唑類與棘白菌素等抗菌藥物，具有抗菌效果好、抗菌譜廣、毒性低等優(yōu)點［1-2］，其血藥濃度與臨床療效相關［3］，是預防和治療全身性真菌病的一線藥物［4］。但口服三唑類藥物泊沙康唑的生物利用度會受到食物攝入量的影響，同時個體間的藥物代謝動力學差異顯著［5］。目前，泊沙康唑主要劑型為口服混懸液，且需與食物（最好是高脂肪餐）同服才能提高生物利用度。腎移植患者常口服泊沙康唑以防治真菌感染［6］，但腎移植術后并發(fā)侵襲性真菌感染導致移植腎失功和受體移植帶功的死亡率達40%［7］。其主要原因為口服泊沙康唑的個體差異性，以及移植腎加劇了其個體差異性［8］，導致患者用藥后血藥濃度未達到有效治療窗或預防濃度感染致死。此外，腎移植術后患者需服用免疫抑制劑，而泊沙康唑會影響其血藥濃度。血藥濃度超出治療窗可能導致肝、腎功能損傷，神經毒性和胃腸道反應，甚至可能影響移植腎的恢復。因此，需實時、快速檢測腎移植患者體內泊沙康唑的血藥濃度，并通過個性化給藥防治真菌感染，降低死亡率。目前，國內外定量檢測泊沙康唑的方法有高效液相色譜串聯(lián)質譜（HPLC - MS/ MS）法［9-11］、超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC - MS/ MS）法［12-13］、還原氧化石墨烯（rGO）和熒光標記的適配體方法［14］。但方法專屬性差，分析時間長，缺少腎移植患者臨床實際用藥指導的相關研究。為此，本研究中建立了精準、快速、高效檢測腎移植患者體內泊沙康唑血藥濃度的HPLC-MS/MS法，并對7例腎移植患者進行了臨床用藥指導，制訂了個體化給藥方案，及時調整給藥劑量，縮短了病程，節(jié)約了治療成本，臨床療效更好。現(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與研究對象

1.1 儀器

1200-G6410B型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（安捷倫科技<中國>有限公司）；CPA225D型電子分析天平（德國賽多利斯有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

泊沙康唑口服混懸液（Patheon Inc.，Whitby Operations，進口藥品注冊證號為H20181110，規(guī)格為每瓶40 mg∶1 mL）；泊沙康唑標準品（批號為3 - JLW - 13 - 1），泊沙康唑-d（4內標，批號為12-MRS-161-1），純度均為98%，均購自美國TRC 公司；乙腈、甲醇（德國默克股份兩合公司）；乙酸銨（廣州化學試劑廠，純度為98%）；試驗用水為蒸餾水；空白血漿由廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院提供。

1.3 研究對象

選取醫(yī)院移植科2020 年12 月至2021 年4 月收治的確診或高度懷疑侵襲性真菌感染、有侵襲性真菌感染高危因素的7 例腎移植術后服用泊沙康唑口服混懸液的患者，其中預防用藥4例、治療用藥3例，共完成13例次血樣檢測。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈 - 10 mmol / L 乙酸銨（85∶15，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件

正離子，電噴霧電離（ESI）源，多反應監(jiān)測（MRM）模式進行定量掃描。離子源：ESI，電壓為4 000 V，溫度為300 ℃；霧化氣流速：6 L/min；碰撞氣壓力：40 psi。其他參數(shù)：質荷比（m/z）泊沙康唑離子對為701.5 →683.6，內標離子對為705.5 → 687.6；碎裂電壓為235 eV；碰撞能量為37 eV；駐留時間為200 ms。

2.2 樣本采集與處理

采用蛋白沉淀法處理血清樣本，患者首次口服泊沙康唑混懸液后第5天，于下一劑給藥前30 min采集血樣5 mL，置無抗凝劑的采血管中，精密吸取100 μL，置2 mL 離心管中，加內標溶液20 μL，渦旋混勻，加乙腈1 mL，渦旋振蕩1 min，離心（溫度為21 ℃，轉速為15 000 r/min）5 min，吸取上清液200 μL，即得供試品。在空白血清樣本處理前加入適量待測物，其他操作與供試品一致，即得加標樣品。取空白血清，按供試品處理方法處理，即得陰性樣品。

2.3 溶液制備

取泊沙康唑標準品2.264 mg，精密稱定，用少量95%甲醇超聲溶解，轉移至5 mL容量瓶中，用95%甲醇定容，即得質量濃度為452.8 μg/ mL 的泊沙康唑貯備液。4 ℃下保存，備用。取內標0.50 mg，精密稱定，加適量95%甲醇超聲溶解，轉移至5 mL 容量瓶中，用95%甲醇定容，即得質量濃度為100 μg/mL 的內標母液，用50%甲醇稀釋成質量濃度為2.00 μg/ mL 的內標貯備液。4 ℃下保存，備用。

根據(jù)不同工作要求，泊沙康唑貯備液用50%甲醇稀釋，配制成所需質量濃度。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別取6 例患者的空白血清和用藥后的血漿（加入內標溶液），按2.2 項下方法處理，得陰性樣品和供試品，按2.1 項下條件進樣分析，色譜圖見圖1。供試品色譜圖中，泊沙康唑和內標的色譜峰峰形良好，保留時間分別為3.618 min 和3.603 min；陰性樣品色譜圖中，內標色譜峰峰形良好，泊沙康唑無信號響應。結果表明，方法專屬性良好，待測物與內標的測定不受樣品內源性物質的干擾。

圖1 高效液相色譜串聯(lián)質譜圖Fig.1 Chromatograms of HPLC-MS/MS

線性關系考察：取空白血清，按2.2項下方法處理，精密加入2.3項下泊沙康唑貯備液適量，配制成泊沙康唑質量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/mL 的系列標準溶液，按 2.1 項下條件進樣分析，以分析物泊沙康唑與內標峰面積的比值（Y）為縱坐標、泊沙康唑質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，以1/（X2）為權重系數(shù)，繪制泊沙康唑標準曲線，得回歸方程Y= 9.192 7X+0.052 1（R2=0.990 2，n= 8）。結果表明，泊沙康唑的血藥濃度在0.05～10.00 μg/mL 范圍內與分析物和內標峰面積比值的線性關系良好，且標準曲線各點的質量濃度偏差均在標示值的±15%范圍內，符合要求。

定量下限確定：同時滿足準確度和精密度要求的標準曲線最低質量濃度為定量下限，即0.05 μg/mL。

殘留檢測：一般情況下，檢測高質量濃度后會存在一定殘留效應，故檢測定量上限（10.00 μg/ mL）樣本后，再檢測3個空白血清樣本，以評價殘留效應。結果均未檢出殘留泊沙康唑，即殘留未超過定量下限的20%［15］，符合要求。

批內、批間精密度試驗［15］：在空白血清樣本中加入相應質量濃度的泊沙康唑及內標，分別制成定量下限和低、中、高質量濃度（0.05，0.15，1.50，8.00 μg/mL）各6 個參比樣品，按2.1 項下條件進樣分析。結果批內、批間精密度試驗結果的均值均在質控樣品標示值的± 15%范圍內，變異系數(shù)（CV）分別為7.16%，3.46%，6.03%，2.67% 和 4.00%，3.28%，4.41%，2.78%（n=18）。

基質效應測定：收集6 例患者的空白血樣，處理后得到空白血清基質，分別加入低、中、高質量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）的質控溶液和內標溶液，進樣分析，記錄峰面積；同質量濃度的質控溶液不經過處理直接進樣分析，記錄峰面積。結果質控溶液基質效應的RSD分別為4.92%，7.75%，2.34%（n=6）；內標溶液基質效應的RSD分別為7.25%，4.94%，7.37%（n=6）。表明基質干擾較小，符合要求［15］。

提取回收試驗：分別配制低、中、高質量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）的質控血清樣本，平行6 份；空白血清樣本處理后加入相應質量濃度的泊沙康唑及內標，制成低、中、高相應質量濃度的參比樣品，平行6份，進樣分析，記錄峰面積。結果低、中、高質量濃度質控血清樣本的平均提取回收率分別為83.08%，87.47%，82.75%，RSD分別為2.67%，3.09%，1.99%（n= 6），表明提取回收率良好。

穩(wěn)定性試驗：1）冷藏及室溫條件穩(wěn)定性。取提取回收試驗項下低、中、高質量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）質控血清樣本，分別在冷藏（4 ℃）和室溫（10～30 ℃）條件下放置24 h和192 h進行預處理，定量分析測得實際濃度，與相應標示濃度對比。結果見表1，RSD均在±15%范圍內［15］，符合要求。2）凍融穩(wěn)定性。泊沙康唑血樣低、中、高質量濃度（0.15，1.50，8.00 μg/mL）質控工作液于冷凍（-12 ℃）條件下保存24 h，取出，置室溫融化后進行預處理；或融化后再放回冷凍（-12 ℃）條件保存，反復3次預處理，進行定量分析，測得實際濃度，與相應標示濃度對比。結果見表1，RSD均在 ± 15%范圍內［15］，符合要求。

表1 穩(wěn)定性試驗結果的RSD（%）Tab.1 RSDs of the stability test（%）

2.5 臨床應用

血藥濃度分布：7例腎移植術后患者正常給藥后，采用HPLC-MS/MS法測定泊沙康唑的血藥濃度。結果顯示，所有樣本泊沙康唑血藥濃度均在0.13～1.27 μg/mL范圍內，4 例預防用藥患者的平均血藥谷濃度為0.37 μg/mL，均未達預防有效濃度（>0.70 μg/mL）；3 例治療用藥患者的平均血藥谷濃度為0.71 μg/ mL，僅1 例達到治療有效濃度（>1.00 μg/mL）［16］。泊沙康唑的吸收有個體差異，且易受多種因素影響，本研究中多數(shù)腎移植患者的血藥濃度未達到有效濃度，故泊沙康唑的血藥濃度監(jiān)測很有必要。

指導用藥：針對上述問題，迅速調整給藥劑量或次數(shù)，制訂個性化用藥方案，多數(shù)腎移植患者用藥后均達到有效血藥濃度。其中，1 例病情嚴重患者經個性化指導后，相較于傳統(tǒng)給藥方法，病程縮短。其臨床資料：男，52歲，體質量52 kg，“慢性腎衰竭”診斷入院，入院后行腎移植手術，術后并發(fā)肺炎，痰培養(yǎng)白色念珠菌（+），給予“泊沙康唑混懸液10 mL，po q12 h”治療，用藥第5天，于下一劑給藥前30 min 采血測得泊沙康唑血藥濃度為0.13 μg/mL，未達到有效治療濃度。次日，詢問患者用藥情況，得知服藥量不足10 mL，且為餐前服藥。隨即對患者進行用藥教育，量裝藥液前需充分振搖藥瓶，混勻后立即倒入量匙，量匙量裝藥液時要裝滿，每次需服用 10 mL（2 勺），每日 2 次，隨餐或餐后 20 min 內服用；并向患者說明隨餐或餐后服用有利于增加泊沙康唑的吸收，提高血藥濃度，達到有效治療濃度。宣教后，患者用藥依從性佳，5 d 后再次測得泊沙康唑血藥濃度為0.52 μg/mL，未達有效治療窗（>1.00 μg/mL）。隨即替換為“泊沙康唑混懸液10 mL，po q 8 h”，達穩(wěn)態(tài)后測得血藥濃度為1.27 μg/mL，繼續(xù)治療，效果較佳。胸片示肺部炎癥基本消失，轉歸，出院回家休養(yǎng)。

3 討論

本研究中對監(jiān)測泊沙康唑血藥濃度的HPLC-MS/MS法進行了優(yōu)化和驗證。結果表明，方法基質效應干擾低；血清中泊沙康唑的濃度在0.05～10.00 μg/mL范圍內有良好的線性關系（R2=0.990 2，n=8），且定量限低，準確度和精密度均良好；方法耐用性好，殘留效應小，提取回收率高。相較于外標法，以同位素泊沙康唑-d4為內標，能降低質譜檢測過程中信號波動帶來的影響。且樣品前處理方便，具有快速、高效、準確的特點，有利于腎移植患者泊沙康唑血藥濃度的快速分析。

由本研究結果可知，采用HPLC - MS/ MS 法檢測患者的血藥濃度，可快速、準確地掌握患者用藥后的實際情況，并及時調整給藥方案，使患者在調整用藥劑量后均達治療有效濃度，較好地控制病情。若未對泊沙康唑血藥濃度進行監(jiān)測，無法確定是否在有效治療窗內發(fā)揮最佳藥效，可能延誤病情，從而累及移植腎甚至危及生命安全；且泊沙康唑口服混懸液價格高昂，若未能實現(xiàn)應有的治療效果，無法發(fā)揮其藥物經濟效應，增加患者的經濟負擔。故需臨床藥師及時、快速掌握患者服用泊沙康唑后的血藥濃度，進行個性化指導用藥，以提高療效，節(jié)約成本。

本研究具有以下局限性：1）受時間限制納入樣本量較少，未能很好地統(tǒng)計泊沙康唑的療效及相關不良反應；2）腎移植患者的生理變化和所服用的其他治療藥物可能影響泊沙康唑的血藥濃度。對于其他因素導致的泊沙康唑血藥濃度的變化需結合臨床具體分析，后期會收集更多的病例數(shù)據(jù)進行進一步分析。