基于新處方工藝的尿素乳膏長期穩定性考察*

朱欣然 ，閆 希 ，沈佩亞 ，胡恩實 ，程 鋼 △

（1. 中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198； 2. 安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科·國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，安徽 合肥 230022； 3. 中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198）

尿素乳膏是皮膚科常用非處方藥，主要成分為尿素，可使角質蛋白溶解變性，增進角質層的水合作用，從而使皮膚柔軟，防止干裂，同時具有抗菌和止癢作用［1］。目前，主藥含量為15%的制劑市場無銷售，仍依靠醫院自制制劑滿足市場需求。安徽醫科大學第一附屬醫院自制尿素乳膏的最早處方來源于《安徽省醫院制劑規范：1999 年版》［2］140，處方為油包水（W/O）型乳膏，但有效期短，隨存放時間的延長外觀性狀易改變，涂布延展性差等。20世紀80年代改基質為水包油（O/W）型，采用混合共融法配制，即取制備乳膏基質的所有成分置同一容器中，加熱熔化至80～90 ℃，然后加入尿素，攪拌成型，油相、水相無需分開配制，步驟簡單，但成品在貯存期的穩定性差，易失水變粗，析出結晶和干粉，有效期僅為6個月。參考文獻并結合多次試驗結果，最終確定參照《安徽省醫院制劑規范：1999 版》中復方二氧化鈦乳膏處方［2］151，以 O/ W 型為乳膏基質，采用混合乳化劑，并增加單硬脂酸甘油酯為穩定劑，擬提高制劑的穩定性。本研究中考察了新舊處方制劑的外觀性狀和物理穩定性，以及新處方留樣制劑12 個月的穩定性，為處方、配制工藝和產品有效期的確立提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），包括 G1310A 型四元泵、G1314BVWD 型紫外檢測器、手動進樣器、Agilent1200 色譜工作站、DT-230A 型柱溫箱；BT25S 型電子天平（賽多利斯科學儀器< 北京>有限公司，精度為十萬分之一）；FA2004 型電子天平（上海精科天平公司，精度為萬分之一）；BiosaferSB-3200 DT-6L 型超聲清洗儀（南京賽飛生物科技有限公司，功率為180 W，頻率為40 kHz）；SPX-150B-Z型生化培養箱（上海博訊實業有限公司）；XL-3型霉菌培養箱（上海虹浦儀器廠）；DM6B 型正置雙目生物顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 試藥

尿素乳膏（醫院制劑，新處方制劑批號分別為20201104，20201109，20201112；舊處方制劑批號為20201125）；尿素對照品（北京盛世康普化工技術研究院，批號為#S14A8134007，純度100%）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為20181221 - 00），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為20180129 - 00），胰酪大豆胨液體培養基（批號為20181218-00），甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號20180122 - 00），十六烷三甲基溴化銨培養基（批號為20180415 - 00），均購自杭州微生物試劑有限公司；乙腈（美國Tedia 公司，批號為20125104）；滅菌注射用水（四川科倫藥業股份有限公司，批號為M21011101A，規格為每支500 mL）。

2 方法與結果

2.1 尿素乳膏制備

取白凡士林30 g、單甘酯50 g、液體石蠟65 g、硬脂酸150 g 作為油相，取純化水400 g、甘油100 g、十二烷基硫酸鈉2 g、三乙醇胺2 g、羥苯乙酯1 g 作為水相，分別加熱至85 ℃，在攪拌過程中將油相緩緩加入水相中，形成初乳，繼續攪拌，使溫度降至70～75 ℃，同時取約100 g 純化水，加熱至 70 ℃，加入尿素 150 g 使溶解，繼續加熱至70 ℃，將尿素溶液緩緩加入初乳中，邊加邊攪拌，持續攪拌至冷凝，即得。按以上處方和配制工藝制備3 批（批號分別為20201104，20201109，20201112）尿素乳膏，每批200盒，每盒裝量50 g。

2.2 尿素含量測定

2.2.1 色譜條件［3］

色譜柱：Zorbax NH2柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 - 水（90∶10，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：190 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取尿素對照品30.7 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為0.614 mg/mL 的對照品貯備液；取 5 mL，置 10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得質量濃度為0.307 mg/ mL 的對照品溶液。取樣品（批號20201104）0.5 g，精密稱定，置50 mL 燒杯中，加流動相20 mL，水浴加熱使溶解，放至室溫，冰浴30 min，濾過，濾液轉移至50 mL 棕色容量瓶中，放至室溫，用流動相稀釋并定容，搖勻；精密吸取2 mL，置10 mL 容量瓶中，以流動相稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。按處方比例制備不含尿素的空白基質乳膏，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性考察：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜圖中尿素的保留時間約為7.04 min，色譜峰峰形良好，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2.2項下對照品貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置5 mL容量瓶中，加流動相稀釋并定容，搖勻，按2.2.1 項下色譜條件進樣分析。以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y = 6.328 6X+84.936（r=0.999 7，n=7）。結果表明，對照品溶液質量濃度在61.4～614.0 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：精密吸取2.2.2項下對照品貯備液適量，加流動相逐級稀釋，按2.2.1 項下色譜條件進樣分析，以3 倍信噪比（S/N）的質量濃度為檢測限，10 倍S/N的質量濃度為定量限。結果檢測限為8.94 μg/mL，定量限為29.80 μg/mL。

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液（質量濃度為0.307 mg/mL）10 μL，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定3 d，每天重復測定6 次，記錄峰面積。結果日內精密度試驗結果的RSD為0.61%（n= 6），日間精密度試驗結果的RSD為1.42%（n=18），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取2.2.2 項下同一批（批號20201104）供試品溶液10 μL，配制完成后分別于室溫放置 0，2，4，6，8，10，12 h 時進樣測定。結果峰面積的RSD為0.51%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置12 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20201104）適量，按2.2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，分別進樣測定，以外標法計算尿素的標示百分含量。結果平均含量為100.33%，RSD為0.75%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號20201104）0.5 g，精密稱定，置燒杯中，加20 mL 流動相，水浴加熱至溶解，冰浴30 min，抽濾，定容至50 mL 棕色容量瓶中，搖勻。精密吸取1 mL，置10 mL 容量瓶中，共9份，分別精密加入對照品貯備液2.0，2.5，3.0 mL，各3 份，分別稀釋并定容，搖勻，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為20201104，20201109，20201112）樣品各適量，精密稱定，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以外標法計算尿素的標示百分含量。結果3批樣品的尿素含量分別為99.66%，97.71%，97.53%。

2.3 長期穩定性考察

長期穩定性考察在接近藥品實際貯存條件下進行，為藥品的最佳貯存條件、制訂藥品有效期提供依據。根據2020 年版《中國藥典（四部）》通則9001 規定，設計常溫（25±2）℃鋁塑膜封口加蓋、常溫未封口直接加蓋、冷藏（5±3）℃鋁塑膜封口加蓋、冷藏未封口直接加蓋4 組，每組取 3 批采用市售包裝，于制備后 0，3，6，9，12 個月末取樣，重點考察其性狀、粒度、裝量、含量、微生物限度［4］457的變化。

性狀：新處方樣品質地均勻、細膩，稠度適宜，易于涂布，在皮膚上具有良好的涂布延展性和滯留性，無變色、酸敗、變硬、油水分離等變質現象。12 個月觀察期內，各組均未出現酸敗、異臭、變色、分層等現象，但常溫未封口組出現了較明顯的發粗干燥現象，涂布延展性下降，部分留樣旋蓋附近有少量結晶粉末析出。

粒度：取樣品少許，置載玻片上，加少許注射用水拌勻［5］，涂抹薄層面積等同于蓋玻片面積，共3片，覆上蓋玻片，輕壓使顆粒分布均勻，按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0982粒度與粒度分布測定法第一法（顯微鏡法）檢視［4］145，應無凝聚現象，并不得檢出50 μm 及以上的粒子。結果各組樣品12 個月觀察期內均未出現粒徑超過50 μm及以上的粒子。

裝量：灌裝前，分別稱量空包裝盒質量、灌裝后稱量總質量，二者之差即為樣品的初始裝量（0 個月），按規定條件貯存，分別于制備后0，3，6，9，12 個月末稱量總質量，并與初始總質量比較，求得裝量變化。結果見表2。可見，12個月觀察期內，各組尿素乳膏的裝量在各考察時間點均有不同程度的減少，按減少量由高到低排序為常溫未封口>冷藏未封口>常溫封口>冷藏封口，常溫未封口組批間和批內差異均較大，其他各組批間和批內差異小。其中，常溫未封口組樣品（批號為20201112）12 個月末裝量減少接近5%，達到不合格臨界值［4］138，而冷藏封口組各批號樣品在整個觀察期內裝量基本不變。表明是否經鋁塑膜封口是影響尿素乳膏裝量變化的關鍵因素，尿素乳膏裝量減少的主要原因為水分揮發，鋁塑膜具有良好的水汽阻隔性，能有效減少因藥品水分揮發和/或空氣中水分侵入導致的裝量變化。考慮到在實際使用中鋁塑膜均為撕開狀態，密封性能下降，為有效延長藥品的有效期，推薦貯存方式為拆封前常溫貯存，無需冷藏，拆封后冷藏貯存。

表2 不同貯存條件下尿素乳膏12個月裝量變化（，g，n=6）Tab.2 Changes of deliverable volume of urea cream prepara?tions under the different conditions for 12 months（，g，n=6）

表2 不同貯存條件下尿素乳膏12個月裝量變化（，g，n=6）Tab.2 Changes of deliverable volume of urea cream prepara?tions under the different conditions for 12 months（，g，n=6）

裝量變化貯存條件 批號 初始裝量常溫封口常溫未封口冷藏封口冷藏未封口20201104 20201109 20201112 20201104 20201109 20201112 20201104 20201109 20201112 20201104 20201109 20201112 55.16±3.17 54.79±1.18 50.70±2.15 54.01±2.10 55.44±4.18 55.10±1.06 55.89±3.84 55.60±3.97 51.47±3.01 56.00±2.28 54.16±4.58 54.58±1.01 3個月末-0.03±0.01-0.03±0.01-0.02±0.01-0.43±0.23-0.64±0.32-0.95±0.78 0.00±0.02 0.00±0.01-0.01±0.01-0.08±0.03-0.10±0.09-0.13±0.05 6個月末-0.04±0.01-0.04±0.01-0.03±0.01-0.69±0.36-1.07±0.53-1.48±1.13 0.02±0.03 0.01±0.01-0.01±0.02-0.16±0.03-0.22±0.17-0.18±0.07 9個月末-0.01±0.01-0.01±0.01 0.00±0.01-0.92±0.42-1.46±0.65-2.11±1.68-0.01±0.02-0.01±0.02-0.02±0.03-0.38±0.17-0.39±0.26-0.29±0.11 12個月末-0.06±0.01-0.07±0.01-0.05±0.01-1.20±0.43-1.69±0.62-2.55±1.74-0.02±0.01-0.01±0.02-0.01±0.02-0.41±0.10-0.46±0.28-0.33±0.12

含量：依據尿素乳膏質量標準，本制劑含尿素（H2NCONH2）應為標示量（g/g）的90.0%～110.0%［6］。分別于0，3，6，9，12 個月末按 2.2.1 項下色譜條件測定以上4 組尿素乳膏制劑中尿素的含量。結果見表3。可見，12 個月觀察期內，各批樣品有效成分含量均呈增加趨勢，按增加程度由高到低排序為常溫未封口> 冷藏未封口>常溫封口>冷藏封口，批間差異較小。增加程度與裝量變化相對應，即裝量減少越多，含量增加越多，同樣由水分揮發所致。盡管4 組各批次尿素乳膏有效成分含量均在90.0%～110.0%之間，符合藥品質量標準，但水分揮發可導致膏體變性，影響涂布延展性等。故推薦的存方式仍為拆封前常溫貯存，無需冷藏，拆封后冷藏貯存。

表3 不同貯存條件下尿素乳膏12個月含量測定結果（，%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of urea in urea cream preparations under different conditions for 12 months（，%，n=3）

表3 不同貯存條件下尿素乳膏12個月含量測定結果（，%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of urea in urea cream preparations under different conditions for 12 months（，%，n=3）

含量貯存條件 批號常溫封口常溫未封口冷藏封口冷藏未封口20201104 20201109 20201112 20201104 20201109 20201112 20201104 20201109 20201112 20201104 20201109 20201112 0個月末99.66±0.70 97.71±0.54 97.53±0.75 99.65±0.70 97.73±0.54 97.52±0.75 99.61±0.70 97.71±0.54 97.50±0.75 99.62±0.70 97.76±0.54 97.52±0.75 3個月末99.40±0.62 99.00±0.91 99.78±0.30 99.22±0.16 99.16±0.14 99.92±0.62 96.96±1.04 97.65±0.08 97.35±1.83 98.60±1.62 97.40±0.18 97.98±0.16 6個月末99.39±0.07 99.24±0.57 100.24±0.29 100.32±0.06 100.29±0.24 100.98±0.43 97.82±0.86 97.94±0.56 97.42±0.22 98.71±0.16 97.73±0.17 98.11±0.14 9個月末99.12±0.55 99.64±0.84 98.85±0.57 101.20±1.48 101.27±2.27 101.44±0.69 98.80±0.47 98.06±0.43 97.33±0.59 98.43±0.46 97.51±0.68 97.79±0.39 12個月末99.83±0.53 98.17±0.47 98.79±1.40 102.60±0.44 101.93±0.37 100.99±0.86 99.31±0.92 99.20±0.37 99.70±0.92 100.41±1.13 99.96±0.49 100.29±0.12

微生物限度：取樣品10 g，加無菌5%聚山梨酯80溶液（45 ℃保溫）至100 mL，混勻，制成1∶10 供試液。取1∶10 供試液按平皿法進行需氧菌、霉菌和酵母菌總數的計數，采用常規法分別進行金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查，按2020 年版《中國藥典》四部通則1105與通則 1106［4］161檢查應符合規定。分別于 0，3，6，12 個月末取樣進行微生物限度檢查，結果3 批（批號分別為20201104，20201109，20201112）樣品的需氧菌、霉菌和酵母菌菌落計數均低于10 cfu/g，均未檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。可見，3 批常溫未封口組乳膏劑在12個月內微生物限度合格，因該貯存方式相對其他3種方式更易染菌，進而可推斷4 種貯存方式在12 個月考察期內均可滿足制劑微生物限度要求。

2.4 新處方工藝與原處方制劑穩定性比較

2.4.1 處方與配制工藝

原處方與新處方成分組成見表4。

表4 尿素乳膏處方（g）Tab.4 Prescriptions of the urea cream preparations（g）

原處方采用混合共融法配制，步驟簡單，但加入尿素后會使膏體變粗，必須放置20 h 以上再攪拌，才能使膏體細膩。究其原因，一是使用單一乳化劑（三乙醇胺與硬脂酸反應生成的一價皂硬脂酸三乙醇胺）乳化效果差，加入尿素時必須快速攪拌，而攪拌過快又會將尿素溶解時產生的氣泡帶入膏體，使乳膏失去細膩光澤感［7］；二是尿素占比較大，其溶解時大量吸熱會使體系溫度快速降低，導致乳膏凝固、膏體變粗。

新處方采用油相加入水相法，使用混合乳化劑（十二烷基硫酸鈉和三乙醇胺與硬脂酸反應生成一價皂，提高了乳膏劑的穩定性［8］；處方中增加了單硬脂酸甘油酯作為穩定劑和增稠劑，兼有一定乳化作用。初乳形成后加入溫度（70 ℃）與之相近的尿素溶液，不需加大攪拌速度，膏體一次成型，避免了因溫度驟降而使膏體變粗。此外，按新處方制備的乳膏劑降溫后即可灌裝，縮短了配制時間，同時也減少了放置過程中微生物污染的可能性。故新處方成品優于原處方。

2.4.2 穩定性比較

性狀：觀察原處方（批號為20201125）與新處方樣品（批號為20201104）0，3，6，12個月末的性狀。結果0個月末時，二者性狀差異不明顯；3 個月末時，原處方乳膏可見增粗；6 個月末時，原處方乳膏已有尿素結晶和基質細粉析出，顏色由亮白變為暗白，光滑度、細膩度均下降，但新處方乳膏仍保持細膩、光滑、易涂布的性狀。

粒度：取常溫未封口組的原處方樣品（批號為20201125）與新處方樣品（批號為20201104），按2020年版《中國藥典（四部）》通則0982粒度與粒度分布測定法第一法（顯微鏡法）檢視［4］145，于顯微鏡下觀察，每個樣品量取并記錄乳粒粒徑各100 個，求得各樣品乳粒粒度［7，9］。結果顯示，原處方乳膏的乳粒粒徑大小不穩定，隨著時間的延長，乳粒粒徑呈增大趨勢（3～6 μm）；而新處方乳膏的乳粒粒徑小于原處方，且大小均一穩定（1.8～1.9 μm），粒徑在12 個月觀察期內變化不大。可見，新處方乳膏更加細膩，儲存穩定性明顯提高。

含量與裝量：取常溫未封口組的原處方樣品（批號為20201125），分別于0，6，12 個月末測定含量和裝量，結果含量分別為101.22%，104.64%，109.20%，裝量分別為50.44，46.91，43.22 g，雖未超出上限（110%），但12個月末的裝量已不合格，故原處方樣品穩定性差，有效期僅為6 個月。新處方樣品在12 個月考察期內均合格，穩定性好。

3 討論

3.1 含量測定方法選擇

尿素乳膏的質量標準源自2020年版《中國藥典（四部）》［4］138，含量測定采用的是顯色后紫外 -可見分光光度法，即對二甲氨基苯甲醛與尿素反應生成黃色的對二甲氨基苯縮脲衍生物后，于420 nm 波長處測定衍生物吸光度，計算出尿素含量。屬間接測定，易受溫度、避光時間、操作人員熟練程度的影響，且顯色劑二甲氨基苯甲醛溶液于420 nm 波長處有較大吸收，導致樣品測定誤差增大［10］。檢驗發現，該方法重復性差，準確度低，不能準確反映乳膏劑的真實含量。故本試驗中參考文獻［3，11］，采用高效液相色譜法測定尿素乳膏的含量。

尿素含有2 個氨基，是小分子極性化合物，采用普通C18柱的保留較弱，尿素出峰快，混雜在溶劑峰中，難以分離。有研究報道，尿素含量測定采用的色譜柱有氨基柱［3，11］、親水色譜柱Xbridge Amide［12］、陽離子交換色譜柱Zorbax 300SCX［13］等，其中氨基柱最常見、使用較多，其氨基鍵合相為極性固定相，可有效地延長尿素的保留時間。故本試驗中采用氨基柱。

預試驗中，比較了多種流動相，包括乙腈-水（90∶10，V/V），乙腈 -0.1%磷酸溶液（90∶10，V/V），乙腈 - 甲醇 - 水（89∶10∶1，V/V/V），發現乙腈 - 水（90∶10，V/V）已可滿足較好的峰形、分離度和理論板數，不必采用更復雜的流動相，故以此為流動相。曾比較190 nm和200 nm測定波長，發現190 nm 波長處較200 nm 波長處的響應值高，故選擇190 nm 為檢測波長。曾比較甲醇、乙醇、水和乙腈-水（90∶10，V/V）分別加熱溶解提取，發現甲醇溶解會產生較大溶劑峰，造成基線不平；乙醇溶解會導致尿素峰拖尾；水溶解會造成油性基質無法除去，過濾時吸附尿素使測定值減小；采用流動相溶解最好，乳膏基質干擾小，沒有溶劑峰，基線平穩。故選擇乙腈- 水（90∶10，V/V）為提取溶劑。

3.2 新處方乳膏穩定性考察結果分析

文獻［14］研究表明，導致乳膏性質改變的主要因素是水分的散失。12 個月觀察期內，從性狀上看，常溫未封口組出現較明顯的發粗、干燥現象，部分留樣旋蓋附近有少量結晶粉末析出；裝量減失按由高到低排序為常溫未封口> 冷藏未封口> 常溫封口> 冷藏封口，含量增加按由高到低排序為常溫未封口> 冷藏未封口> 常溫封口> 冷藏封口，增加程度與裝量變化相對應，即裝量減少越多，含量增加越多。

依據2020年版《中國藥典》最低裝量檢查法“20～50 g固體、半固體每個容器的裝量不得少于標示裝量的95%，即不得減少標示量的5%”。常溫未封口組樣品（批號為20201112）第12 個月裝量減少接近5%，為不合格品，而冷藏封口組各批號樣品在整個觀察期內裝量基本不變。可見，是否經鋁塑膜封口是影響尿素乳膏穩定性的關鍵因素，而封口狀態下是否冷藏對尿素乳膏穩定性的影響不大。為延長其有效期，應盡量減少水分散失，推薦貯存方式為拆封前常溫貯存，無需冷藏，拆封后冷藏貯存。

新處方為混合乳化劑，采用分別加熱配制的方法，配制方法為將內相加入外相的逆相轉型法［15］，不需轉相，轉型后細膩度佳，無顆粒感。本研究中性狀對比、粒度檢查、耐熱試驗、耐寒試驗、離心試驗等物理穩定性研究結果表明，新處方乳膏穩定性好，乳粒的粒徑明顯小于原處方，膏體潔白細膩，有光澤，無粗糙感，具有適宜的黏稠度和涂布延展性，久置不分層，無結晶析出。綜合考察試驗結果和臨床治療需求，最終選擇新處方工藝投入生產。醫院制劑的特點是批量小、批次多、周轉快、有效期一般在1 年內，故本試驗中暫考察了12 個月的穩定性。結果表明，新處方制劑的有效期可延長至12 個月，為使結論更可靠，還需進一步考察18～24 個月的穩定性。目前，本試驗中采用的尿素乳膏市售包裝為聚乙烯塑料盒，未來可更換為鋁塑復合管、鋁制軟管等再進行試驗，以尋找最佳包裝方式和貯藏條件。