荊防合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

莊會(huì)芳 ，徐 麗 ，袁曉梅 ，孫曉蘭 ，劉思延 ，金 鳳 ，范建偉 △

（1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006； 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司·中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006）

荊防合劑基于荊防敗毒散，經(jīng)現(xiàn)代中藥制藥工藝提取濃縮而成，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡等11 味中藥組方，具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕功效，主治感冒風(fēng)寒諸癥［1］。荊防合劑在新冠肺炎疫情防控中發(fā)揮了積極作用，四川、云南、廣東、新疆等地將荊防敗毒散及其成方制劑列入防治推薦用藥［2］。目前，荊防合劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍為原衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1377-93，僅規(guī)定了制劑的性狀、相對(duì)密度及其他通則項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目，缺乏薄層色譜定性鑒別項(xiàng)和液相色譜含量測(cè)定項(xiàng)，難以全面控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。且國(guó)內(nèi)荊防合劑的批準(zhǔn)文號(hào)較多，市售產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。為確保荊防合劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性和臨床用藥的安全、有效，本研究中采用薄層色譜法對(duì)方中川芎、荊芥、羌活、防風(fēng)、柴胡、甘草6 味中藥進(jìn)行定性鑒別，采用雙波長(zhǎng)高效液相色譜法對(duì)紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷3個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行定量檢測(cè)，為提升荊防合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司），配有光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、Empower色譜工作站；TLC Visualizer 2型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；XS105DU 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司，精度為萬(wàn)分之一）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為450 W，頻率為40 kHz）；H1650 - W 型臺(tái)式微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Milli - Q 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；硅膠G60 薄層板、硅膠G60 F254薄層板（德國(guó)Merck公司）。

1.2 試藥

胡薄荷酮對(duì)照品（批號(hào)為111706 - 201907），升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)為111522-201913），柴胡皂苷d對(duì)照品（批號(hào)為110778-201912），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731-201720），紫花前胡苷對(duì)照品（批號(hào)為111821-201604，含量以99.6%計(jì)），柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110722 - 201815，含量以91.7%計(jì)），新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111857-201804，含量以99.4%計(jì)），川芎對(duì)照藥材（批號(hào)為120918 - 201813），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；荊防合劑（魯南厚普制藥有限公司，規(guī)格為每支 10 mL，批號(hào)分別為 245210081，245210091，245210101，24521012，24521013，24521014，24521015，24521016，24521017，24521018，依次編號(hào)為S1-S10）；聚酰胺30-60目（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為F20070411）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

川芎、荊芥：取樣品30 mL，置250 mL 燒瓶中，加水70 mL 和沸石數(shù)粒，連接揮發(fā)油測(cè)定器，從測(cè)定器上端加水至溢流入燒瓶時(shí)為止，再用移液管加入1 mL 乙酸乙酯，連接回流冷凝管［3］，加熱至沸，并保持微沸30 min，放冷，分取乙酸乙酯層，作為供試品溶液。取胡薄荷酮對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取川芎對(duì)照藥材0.5 g，加20 mL 甲醇，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再按荊防合劑處方工藝分別制備缺川芎和缺荊芥的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備缺川芎陰性對(duì)照品溶液和缺荊芥陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與川芎對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 A。再噴以5%香草醛硫酸溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與胡薄荷酮對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 B。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

羌活：取樣品10 mL，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，下層水液備用，蒸干乙酸乙酯，殘?jiān)? mL 水，上聚酰胺柱（3 g，干法上柱，內(nèi)徑10 mm），以50 mL水洗脫，棄去洗脫液，再以40 mL乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL 使溶解，作為供試品溶液。取紫花前胡苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按荊防合劑處方工藝制備缺羌活的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（6∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 C。

防風(fēng)：取羌活項(xiàng)下下層水液，加80 mL 正丁醇，搖勻，用氨試液洗滌3次，每次30 mL，棄去上清液，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL 使溶解，作為供試品溶液。取升麻素苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按荊防合劑處方工藝制備缺防風(fēng)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）通則0502 項(xiàng)下薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20 μL 和對(duì)照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇（5∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 D。

柴胡：取樣品10 mL，加乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用氨試液洗滌2 次，每次30 mL，棄去上清液，取乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL 使溶解，再加稀鹽酸2 滴，搖勻，作為供試品溶液。取柴胡皂苷d 對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，再加稀鹽酸2 滴，搖勻，作為對(duì)照品溶液。再按荊防合劑的處方工藝制備缺柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2，V/V/V）10 ℃以下靜置的下層溶液為展開(kāi)劑［4-5］，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，于60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 E。

甘草：取樣品10 mL，加5 mL稀鹽酸，超聲處理10 min，離心，棄去上清液，沉淀用10 mL 0.5%碳酸氫銨溶液溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，棄去正丁醇液，下層水液加冰醋酸3 mL，搖勻，再加水飽和的正丁醇溶液振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)?.5 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取甘草酸銨對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按荊防合劑的處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯 - 甲酸 - 冰醋酸 - 水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 F。

2.2 紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

參照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）通則0512 高效液相色譜法和參考文獻(xiàn)［6 - 9］開(kāi)展預(yù)試驗(yàn)，確定如下色譜條件。色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～35 min 時(shí) 16%A，35～36 min 時(shí) 16%A →90%A，36～44 min 時(shí)90%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：336 nm（紫花前胡苷），283 nm（柚皮苷和新橙皮苷）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。在此色譜條件下，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的理論板數(shù)均大于3 000，分離度均大于1.5。

2.2.2 溶液制備

精密吸取荊防合劑2 mL，置50 mL 容量瓶中，用30%甲醇稀釋并定容，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別取紫花前胡苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品16.97，28.59，21.84 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，以50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得各單一成分對(duì)照品貯備液。分別精密吸取各單一成分對(duì)照品貯備液4，3，3 mL，置同一25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得每1 mL分別含紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷54.08，62.92，52.10 μg 的混合對(duì)照品溶液。根據(jù)荊防合劑的處方工藝，分別制備缺羌活的陰性樣品和缺枳殼的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備缺羌活陰性對(duì)照品溶液和缺枳殼陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各5 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，相應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)下，供試品溶液、對(duì)照品溶液色譜圖中，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷在各自的保留時(shí)間處均有吸收峰，且峰形對(duì)稱；相應(yīng)陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，在紫花前胡苷和柚皮苷、新橙皮苷相應(yīng)保留時(shí)間處均無(wú)吸收峰，表明方法專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2項(xiàng)下單一成分對(duì)照品貯備液各適量，依次置相同容量的不同容量瓶中，分別用50%甲醇制備系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。其中，紫花前胡苷的質(zhì)量濃度分別為10.14，20.28，33.80，50.70，67.60，135.20 μg/mL，柚皮苷的質(zhì)量濃度分別為10.49，20.97，52.43，78.64，104.86，157.29 μg/mL，新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為8.68，17.37，34.74，43.42，65.13，86.84 μg/mL。精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的回歸方程分別為Y紫=1.319×104X紫-1.773×10（4r=0.999 8），Y柚=9.078 × 103X柚-1.365 × 104（r=0.999 4），Y新=9.719×103X新+8.804×10（3r=0.999 5）。結(jié)果表明，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別在 10.14～135.20 μg/ mL，10.49～157.29 μg/ mL，8.68～86.84 μg/mL范圍內(nèi)與相應(yīng)峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.30%，0.31%，0.47%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（編號(hào)為S1）供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.50%，0.55%，0.55%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）適量，精密稱定，按2.2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為1.48，1.73，1.21 mg/g，結(jié)果的RSD分別為0.71%，0.86%，0.85%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：依次取紫花前胡苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品14.87，18.87，12.13 mg，精密稱定，置同一50 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品貯備液（紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的質(zhì)量濃度依次為296.21，346.08，241.14 μg/mL）；精密吸取已知含量的樣品（編號(hào)為S1）1 mL，共6份，分別置50 mL 容量瓶中，各精密加入上述混合對(duì)照品貯備液5 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品（編號(hào)為S1-S10），按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各平行3 份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of nodakenin，naringin and neohesperidin in the samples（n = 3）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

本研究在川芎、荊芥的鑒別中，采用蒸餾油法制備供試品溶液，并用同一展開(kāi)劑分別實(shí)現(xiàn)了川芎（顯色前）和荊芥（顯色后）的定性鑒別；在羌活、防風(fēng)的鑒別中，采用“步進(jìn)式”供試品處理方法，簡(jiǎn)化了操作，提高了檢測(cè)效率；在柴胡的鑒別中，通過(guò)滴加稀鹽酸使柴胡皂苷能有效轉(zhuǎn)化為皂苷元，結(jié)果顯色斑點(diǎn)更清晰、穩(wěn)定，特征性更強(qiáng)；在甘草的鑒別中，結(jié)合大量預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液酸堿性實(shí)現(xiàn)對(duì)甘草中甘草酸銨的有效鑒別。

在展開(kāi)系統(tǒng)的選擇方面，針對(duì)羌活的鑒別，因紫花前胡苷為羌活主要活性成分［10］，故以紫花前胡苷為對(duì)照，確定三氯甲烷 -甲醇（6∶1，V/V）為展開(kāi)劑；針對(duì)防風(fēng)的鑒別，參考了三氯甲烷 - 甲醇（4∶1，V/V）［11］156、二氯甲烷 - 甲醇 - 甲酸（16∶4∶1，V/V/V）［12］等不同展開(kāi)系統(tǒng)，最終確定以三氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）為展開(kāi)劑。

3.2 含量測(cè)定

分別考察了乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液和甲醇- 0.2%甲酸水溶液、甲醇- 0.1%磷酸水溶液4 組流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果在乙腈- 0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)下，供試品溶液色譜圖基線平穩(wěn)；相應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)下，紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷色譜峰的對(duì)稱性和分離度均較好，故選用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，以梯度洗脫模式進(jìn)行分析。由于羌活中紫花前胡苷在336 nm 波長(zhǎng)處有最大紫外吸收，而枳殼中的柚皮苷、新橙皮苷在283 nm 波長(zhǎng)處有最大紫外吸收，故在同一液相色譜條件下，采用雙波長(zhǎng)法對(duì)這3個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行定量分析，且分離效果良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。此外，同時(shí)測(cè)定這3 個(gè)指標(biāo)性成分的含量，較單一成分檢測(cè)更科學(xué)、合理。

本研究中10 批荊防合劑生產(chǎn)投料所用羌活藥材中，紫花前胡苷含量介于18.59～26.78 mg/ g，平均22.68 mg/g，其成分轉(zhuǎn)移率以80%計(jì)，暫定羌活中紫花前胡苷含量的最低限度為18.14 mg/g。所用枳殼藥材中，柚皮苷含量介于40.06～52.75 mg/g，平均46.40 mg/g；新橙皮苷含量介于31.22～39.53 mg/g，平均35.38 mg/g，二者均高于2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中枳殼項(xiàng)下柚皮苷含量的最低限度40.0 mg/g和新橙皮苷含量的最低限度30.0 mg/g［11］257。結(jié)合 2.2.4 項(xiàng)下含量測(cè)定結(jié)果，計(jì)算得紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷3 個(gè)指標(biāo)性成分含量的轉(zhuǎn)移率分別介于60.05%～86.69%（平均73.37%）、38.43%～50.87%（平均44.65%）、35.26%～37.54%（平均36.40%）。按平均轉(zhuǎn)移率的80%計(jì)算，則荊防合劑中紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量下限分別為1.07，1.39，0.85 mg/mL。故暫定本品每1 mL 含紫花前胡苷不得少于1.0 mg，含柚皮苷不得少于1.3 mg，含新橙皮苷不得少于0.8 mg。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于荊防合劑的質(zhì)量控制。