環境微生物數據庫的建立及在溯源分析中的應用*

趙麗元，丁紅雨，高洪霞，張敬武，張興哲

（遼寧省大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連 116021）

在無菌藥品的生產中，環境監控是評估生產環境微生物污染情況的重要手段，我國《藥品生產質量管理規范》（GMP）［1］及美國GMP［2］中均有明確要求。環境監控數據中的微生物數據，不僅要關注數量，更應關注其種類和特點，即對環境監控過程中發現的污染菌進行鑒定，并根據情況選擇性保存，定期對相應數據和信息進行匯總和分析，這一措施稱為環境菌數據庫建設［2-3］。建設環境菌數據庫，有助于建立和健全企業微生物監控方法，完善企業微生物風險評估和質量保證體系，增強微生物污染的溯源分析能力，從源頭上避免微生物污染，保證藥品質量［4-9］。本研究中通過收集、鑒定一家無菌藥品生產企業環境菌，建立了覆蓋藥品生產全過程的企業生產環境微生物數據庫，形成環境微生物分布圖，通過分布圖全面客觀地掌握生產環境。此外，利用數據庫為企業成功進行了一次無菌污染事件溯源分析，供更多企業的溯源分析時借鑒。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、培養基和試劑、引物

儀器：AC2 - 4S1 型生物安全柜（新加坡Esco 公司）；VITEK 2 COMPACT型全自動微生物藥敏與分析系統，VITEK?MS型MODI-TOF質譜儀，均購于法國梅里埃公司；BAXQ7型全自動病原微生物快速檢測系統，全自動微生物基因指紋鑒定系統均購于杜邦公司；DYCP-31CN 型瓊脂糖凝膠電泳儀及成像系統（美國Bio-Rad公司）；BD240型生化培養箱（德國Binder公司）。

培養基和試劑：胰酪大豆胨瓊脂培養基，沙氏葡萄糖瓊脂培養基，均購于北京陸橋有限公司；裂解液，聚合酶鏈式反應（PCR）酶Premix Taq，均購于寶生物工程（大連）有限公司。

引物：細菌用16srRNA 通用擴增引物27F 和1492R，霉菌用引物ITS1 和 ITS4，酵母菌用引物 D1 和D2 進行測序，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.2 方法

環境微生物監控：與企業共同制訂環境監控方案，監測項目包括原輔料、包裝材料、環境監測、人員、制藥用水、表面消毒、除菌過濾膜、質量控制實驗室8 個方面，基本覆蓋了生產和檢驗的全過程，歷時10 個月，監測頻率以生產情況和已往的風險評估數據為準。

微生物鑒定：將收集到的微生物分離培養、純化后進行鑒定，同時用20%甘油保存菌種，作為環境微生物菌種實物庫。鑒定以分子水平鑒定為主，如有疑問可以生化鑒定為補充。1）菌體裂解。取1 接種環或槍頭尖接種入50 μL 裂解液中，80 ℃裂解15 min（真菌需裂解45 min），離心（轉速為3 000 r/min）2 min，取上清液，作為 PCR 模板。2）PCR 反應體系（50 μL）。模板 3 μL；Premix Taq 25 μL；上游引物 1 μL；下游引物1 μL；雙蒸水（ddH2O）20 μL。3）PCR 條件。94 ℃預變性 10 min，94 ℃變性1 min；55 ℃退火1 min（真菌58 ℃退火1 min）；72 ℃延伸1 min，40 個循環；72 ℃再循環5 min。4）測序。PCR 產物由生工生物工程（上海）股份有限公司以對應引物為測序引物進行一代測序。

測序結果分析：將測序結果拼接核對后，利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫進行Blast 比對分析，獲得菌種的分類信息。經聚類分析比對正確后，同時得到環境微生物核酸序列庫，用于分析和溯源。

2 結果與分析

2.1 環境微生物分布圖建立

生產車間 B 級、C 級、D 級環境共 31 個房間和走廊中，共收集并鑒定到24 個種屬的171 株微生物。生產車間A級環境控制良好，未收集到微生物。其中，葡萄球菌屬和微球菌屬是監控到的主要菌屬，每個級別環境微生物鑒定結果見表2。可見，盡管B 級環境微生物很少，但B級環境與無菌生產的A級環境較接近，應高度重視B 級環境出現菌。C級環境中葡萄球菌屬占比很高，幾乎每個房間均含有；D 級環境也以葡萄球菌屬（38.89%）、微球菌屬（24.60%）為主，主要污染微生物還是人員污染菌，并以走廊、清洗室、烘干室及男女更衣室的種類較多。D級環境中126株微生物分布圖見圖1。

圖1 生產車間D級環境不同區域微生物分布圖Fig.1 Microbial distribution in different areas of level-D environment in a workshop

表2 生產車間環境監控微生物鑒定結果（n=171）Tab.2 Results of environmental microorganism identification in a workshop（n=171）

2.2 溯源分析

企業中試試驗無菌檢查樣品中發現了陽性樣品，經過16srRNA 分離鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus strain（菌種編號為2019085，2019088），與環境庫中找到的7 株蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus strain（來源見表3）進行菌株水平的鑒定，以找到真正的污染源。

表3 環境中蠟樣芽孢桿菌的來源Tab.3 Sources of Bacillus cereus strain in the environment

由于16srRNA 測序分析無法將蠟樣芽孢桿菌分析到菌株水平，因此采用核糖體分型技術進行溯源分析。選用2 種限制性內切酶進行酶切，分型結果見圖2。可見，用EcoRⅠ酶切后，9株菌聚類分析圖譜很相近，基本都在0.95 以上，故此酶無法將這些污染微生物進行溯源分析，區分能力有限；用PvuⅡ酶切，9 株菌可被較好地聚類，樣品污染菌2019085 和2019088 與數據庫中的環境菌2019261 和2019291 聚類到一起，基本達到0.95的遺傳距離，可認為帶型一致，而其他菌的相似度低于0.7，應不是同源。故樣品污染菌與環境菌2019261 和2019291 親緣關系較近，中試樣品中的污染微生物很可能來源于生產區B級脫無菌衣室（2019261）或質量控制實驗室陽性間（2019291）。質量控制實驗室陽性間的操作是在檢驗結束后，而無菌試驗過程全程監控未發現異常，故在質量控制實驗室污染的可能性不大。在生產區B 級脫無菌衣室發現的蠟樣芽孢桿菌與產品生產非常接近，更可能為真正的污染源。

圖2 蠟樣芽孢桿菌EcoRⅠ和PvuⅡ酶切核糖體分型結果Fig.2 Results of ribotyping of Bacillus cereus strain by EcoRⅠ and Pvu Ⅱ

3 討論

3.1 環境微生物數據庫的建立

所建立的環境微生物數據庫涵蓋了生產的全過程。生產區是核心部分，主要對生產區進行了考察，其中葡萄球菌屬是主要的污染菌，B 級、C 級、D 級分別占70.00%，51.43%，38.89%。可見，人員污染是環境污染的主要原因，與文獻［5-8，10］結果相似。D級環境菌種類別相對較多，可能是采樣時為了擴大采集范圍增加了很多表面微生物的采集，因此收集到較多種類的微生物。質量控制實驗室的監控主要為污染調查時應用，當出現污染事件時，要排除試驗誤差，客觀掌握無菌環境中的微生物，才能很好地判定試驗結果。

3.2 溯源分析方法

環境微生物數據庫的主要作用之一是用于溯源分析，當出現污染或有可疑結果時，可通過數據庫對可疑菌進行查詢。環境微生物數據庫一般是以基因庫16srRNA 序列庫為基礎，結果的準確性全依靠16srRNA的準確性，受16srRNA 的局限性影響，部分菌種只能將菌鑒定屬水平，無法進一步分析。對于環境微生物中風險不是很高的區域的微生物，鑒定到屬水平可滿足相關的監管需求［1-2］。當需要進行溯源分析時，再將污染微生物從菌種保藏管中取出，采用其他適宜的方法進行菌株水平鑒定［11-15］，如核糖體分型、多位點序列分型（MLST）、脈沖場電泳、看家基因和全基因組測序等。每種溯源分析方法針對不同的菌屬均有不同優勢，需通過實驗具體分析。本研究中采用核糖分型方法對蠟樣芽孢菌進行溯源分析，以及不同酶進行酶切，結果差異大。因此，溯源分析的實驗人員須具有一定的經驗和技巧。

3.3 風險評估

環境監控需要更多考慮到風險評估風險調查的數據，以及潛在的風險區域。本研究中D 級應當是個相對風險較低的區域，如果D 級區有A 級層流，就應加強重視，D 級區的菌是否可通過屏障帶入A 級區域就需進行一定的風險調查。

3.4 無菌保障

環境微生物數據庫的建立在企業生產中有很多應用［16］，主要用于為企業溯源分析提供依據。藥品生產工藝復雜，生產步驟多，對于無菌藥品更是對環境控制要求更高，一旦出現污染事件則調查難度大。隨著監管和數據完整性要求的加大，建立環境微生物數據庫將成為無菌保障的重要手段，溯源分析能力將成為企業風險管理的重要能力。