基于指紋圖譜結合化學計量學的香砂平胃顆粒質量評價

元曉靜

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院，福建 福州 350000）

香砂平胃顆粒是由炒蒼術、姜炙厚樸、陳皮、醋香附、甘草、砂仁制成的中藥復方制劑，具有健脾、溫中、燥濕功效，用于治療飲食不節、食濕互滯、胃脘脹痛、消化不良［1］。《中華人民共和國衛生部藥品標準 中藥成方制劑》WS3- B2369 - 97 中僅有顆粒劑檢查項，相關文獻僅采用高效液相色譜（HPLC）法對方中姜炙厚樸、陳皮的3個成分做了定量檢測。指紋圖譜結合化學計量學已廣泛用于評價中藥及其制劑的質量，其中指紋圖譜通過HPLC 法得到中藥或中藥制劑的特征成分色譜圖，借助相似度評價系統，實現對中藥及其制劑內在質量的一致性評價和產品穩定性的全面監測［2-4］。聚類分析（CA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等化學計量學方法可對分散的數據進行分析［5-7］，發揮其高預測精度優勢，篩選出質量差異標志物，二者結合既能體現整體信息，又能說明個體差異。本研究中通過建立HPLC 指紋圖譜結合化學計量學分析出不同批次香砂平胃顆粒的相似性和穩定性，篩選出差異性成分，為香砂平胃顆粒標準的全面提升提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），配有可變換波長紫外檢測器；BT55S 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為0.01 mg）；KQ -550D型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

對照品蒼術素（批號為111924 - 202006，含量99.3%），厚樸酚（批號為 110729 - 202015，含量99.4%），和厚樸酚（批號為 110730 - 202111，含量99.1%），橙皮苷（批號為 110721 - 202116，含量95.3%），川陳皮素（批號為 112055 - 202102，含量99.6%），甘草苷（批號為 111610 - 202113，含量97.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；蒼術醇（成都曼思特生物其余科技有限公司，批號為200759-21-4，純度為99.1%）；其余試劑均為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水；香砂平胃顆粒［云南騰藥制藥股份有限公司，規格為每袋10 g，共14 批，編號為S1 - S5（生產于2021年），S6-S10（生產于2020 年），S11-S14（生產于2019年）］。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTERRA C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相［8-10］：乙腈（A）- 0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時 20%A → 45%A，20～32 min 時45%A → 60%A，32～43 min 時 60%A，43～60 min 時60%A → 85%A）；波長：220 nm（20～32 min 時蒼術素、蒼術醇），284 nm（0～20 min時甘草苷、橙皮苷，32～60 min，厚樸酚、和厚樸酚、川陳皮素）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取蒼術素、蒼術醇、厚樸酚、和厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素、甘草苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，得質量濃度分別為0.113 2，0.100 5，0.100 2，0.098 6，0.057 4，0.050 1，0.030 8 mg/mL的混合對照品溶液。

取樣品5 袋，研勻，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率為450 W）40 min，稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

按處方組成和生產工藝分別制備缺炒蒼術、姜炙厚樸、陳皮和甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號為S2）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次。結果以12號峰蒼術素為參照，其余22個共有峰相對保留時間的RSD為0.39%～0.57%（n=6），相對峰面積的RSD為1.18%～1.74%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，3，6，9，12，15，20 h時進樣測定。結果顯示，以12號峰蒼術素為參照，其余22個共有峰相對保留時間的RSD為0.46%～0.72%（n= 7），相對峰面積的RSD為1.33%～1.85%（n=7），表明供試品溶液在20 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（編號為S2）各適量，共6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果以12 號峰蒼術素為參照，其余22 個共有峰相對保留時間的RSD為0.13%～0.26%（n=6），相對峰面積的RSD為1.05%～1.42%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜［11-12］

指紋圖譜建立及相似度評價：取14批樣品（編號為S1 - S14），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣分析。根據中藥指紋圖譜相似度評價系統2012A 版，以編號為S2 樣品的色譜圖為參考，建立香砂平胃顆粒指紋圖譜的共有模式，確定共有峰23個，詳見圖1。其中，12號峰（蒼術素）保留時間適中，色譜峰響應最大，故選擇為參照峰（R）。與對照圖譜比較，各指紋圖譜的相似度在0.971～0.994 之間，表明樣品各批次間共有成分基本一致。相似度評價結果見表1。

表1 14批香砂平胃顆粒相似度評價結果Tab.1 Results of similarity evaluation of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

圖1 14批香砂平胃顆粒高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

共有峰指認及歸屬：取2.2項下混合對照品溶液和陰性對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并與圖1 進行對比指認，結果見圖2 和圖3。共有峰中，3，4，9，12，17，20，21 號色譜峰分別指認為甘草苷、橙皮苷、蒼術醇、蒼術素、川陳皮素、和厚樸酚、厚樸酚；其中，3 號峰歸屬于甘草，4 號峰和17 號峰歸屬于陳皮，9號峰和12號峰歸屬于炒蒼術，20號峰和21號峰歸屬于姜炙厚樸。

圖2 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

圖3 陰性對照品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of negative reference solution

2.5 CA

采用SPSS 24.0統計學軟件分析，以14批樣品中23個共有峰的峰面積為變量，采用組間連接CA［13］。由圖4可知，14 批樣品按生產年份可聚為三類，分別為S1-S5，S6-S10，S11-S14。

圖4 14批香砂平胃顆粒聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

2.6 OPLS-DA

以14 批樣品中23 個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進行 OPLS-DA［5，14］，得出造成 3 組間差異的標志性共有峰，詳見圖5。結合變量重要性投影值（VIP）篩選出導致14 批樣品差異的主要共有峰。以VIP>1 為標準，篩選出5 個差異性標志物的色譜峰，分別為7號峰、9號峰（蒼術醇）、20號峰（和厚樸酚）、21號峰（厚樸酚）、16 號峰，表明上述峰的差異對分類的影響較大。詳見圖6。

圖5 14批香砂平胃顆粒OPLS-DA得分散點圖Fig.5 OPLS-DA scoring plot of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

圖6 共有峰VIP圖Fig.6 VIP plot of common peaks

3 討論

圖6 顯示，造成樣品質量差異的5 個差異性標志物的色譜峰分別為7 號峰、9 號峰（蒼術醇）、20 號峰（和厚樸酚）、21號峰（厚樸酚）、16號峰，其中20號峰和21號峰均來源于姜炙厚樸，9 號峰來源于炒蒼術。因此，建議生產企業將蒼術醇、厚樸酚、和厚樸酚作為內控指標納入含量測定，并嚴格把關藥材質量，以保證產品的均一性。

本研究中采用波長切換法建立了14 批樣品的HPLC 指紋圖譜，相似度值均>0.970，表明產品化學成分一致性較好。HPLC指紋圖譜共標定23個共有峰，指認出其中7個共有峰，化學計量學分析將14批樣品按生產年份聚為三類，表明不同年份樣品間的質量存在一定差異，編號為S11-S14 中7 個成分的含量較低，可能與樣品生產時間較長有關，可進一步考察產品穩定性。

綜上所述，所建立的HPLC 指紋圖譜結合化學計量學的方法可用于香砂平胃顆粒的質量控制，為該制劑質量標準的提升提供參考。