不同化學型樟樹精油的化學成分和抑菌效果研究

胡 珊，梁衛驅，黃 皓，侯 晨，陳杰連，徐 匆，羅華建，連輝明，陳仕麗，謝佩吾*

(1.東莞市農業科學研究中心，廣東東莞 523000；2.廣東省林業科學研究院，廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東廣州 510520)

樟樹(Cinnamomumcamphora)，又名香樟、烏樟、樟木、芳樟等，是亞熱帶地區重要的材用和特種經濟樹種，其根、木材、枝、葉均可提取精油[1]。樟樹精油具有芳香氣味和良好的防腐、消炎、抗病毒、殺菌、殺蟲等活性，目前被應用于香料、醫藥和食品工業等行業，具有廣闊的研究前景[2-3]。樟樹精油成分因各個地域的環境、氣候等差異而不盡相同。大多數學者根據樟樹精油的成分所含的主要化學成分的不同將其劃分為5種化學型：主含芳樟醇(17.30%～84.83%)的芳樟型、主含樟腦(10.00%～75.03%)的樟腦型、主含桉葉油素(30.70%～58.51%)的油樟型、主含異橙花叔醇(20.74%～42.00%)的異樟型、主含龍腦(67.06%～81.78%)的龍腦樟型[4-7]。不同化學型樟樹精油的化學成分和理化性質不同，生物活性亦有差異。樟樹精油的大多數化學成分有殺菌、抑菌的作用。Chen等[8]研究發現樟樹精油對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、雞沙門氏菌和大腸桿菌等具有良好的抗菌活性。陶翠等[9]研究發現油樟葉揮發油對須毛癬菌、犬小孢子菌和石膏小孢子菌 3株真菌具有較強的抗真菌活性。鄧海英等[10]研究樟樹葉乙醇提取物和水提取物對4種細菌的抗菌活性，結果表明2種提取物對G+菌及G-菌均有不同程度的抑制作用。胡小剛等[11]在芳樟醇R-和S-對映異構單體的體外抗菌活性研究中發現，2種芳樟醇對金黃色葡萄球菌等細菌均具有抗菌活性，R-芳樟醇對部分細菌抗菌活性稍強于S-芳樟醇。Pragadheesh等[12]研究發現樟樹精油對瓜褐腐病有良好的抑制作用。有關樟樹精油抑菌作用的研究已有較多報道，其中主要研究同種化學型對不同菌的抑菌作用，而針對不同化學型樟樹精油對相同病原菌的抑菌作用比較分析鮮見報道。該研究選取應用較為廣泛2種化學型(芳樟型和龍腦樟型)樟樹，采用水蒸氣蒸餾法提取2種樟樹葉的精油，利用GC-MS 法對比分析2種樟樹葉精油化學成分的差異，并以多種常見的農作物病害病原菌為研究對象進行抑菌作用研究，以期為拓寬樟樹精油的開發利用思路和開發綠色安全植物病原菌防治藥劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1新鮮樟樹樹葉。龍腦樟由廣東華清園生物科技有限公司提供；芳樟由廣東省林業科學研究院提供。

1.1.2培養基。馬鈴薯瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.1.3供試植物病原菌。甘蔗赤腐病菌(ColletotrichumfalcatumWent)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、花生褐斑病菌(CercosporaarachidicolaHori)、水稻惡苗病菌(FusariummoniliformeSheld)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)由華南農業大學植物病理系贈送。冬瓜根腐病菌(Fusariumsolani)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.momdicae)、冬瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(schl.)f.sp.benincasae)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)，由東莞市農業科學研究中心分離保存。

1.1.4試驗設備。GCMS-QP2020W/O氣相色譜質譜聯用儀(日本島津公司)；TC-15套式恒溫器(海寧市華星儀器廠)；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；SW-CJ-1F 潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；LRH-250 生化培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1精油提取[13]。采用《中華人民共和國藥典》(2015版)附錄XD水蒸氣蒸餾法提取龍腦樟樹葉和芳樟樹葉葉片精油。為減少揮發，采摘回實驗室的鮮葉在7 d內按照采樣順序完成精油提取工作。所得精油在0～5 ℃條件下保存，用于精油成分分析。

1.2.2樟樹葉精油成分分析。

1.2.2.1氣相條件(GC)。升溫程序：初始柱溫為70 ℃，以2 ℃/min 速度升溫至160 ℃保持2 min，再以10 ℃/min速度升溫至220 ℃，保持5 min，全程共運行51 min。進樣量0.5 μL，采用分流的方式進樣，進樣口溫度230 ℃。載氣為氦氣，過柱載氣恒流速為1.19 mL/min。

1.2.2.2質譜條件(MS)。離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍(m/z)50～500。溶劑延遲3 min。

1.2.2.3化合物鑒定。將總離子流圖中各峰經質譜掃描后得到質譜圖，通過標準質譜圖庫進行檢索分析鑒定，并采用峰面積歸一定量法計算各組分在揮發油中的相對百分含量[14]。

1.2.3樟樹葉精油抑菌作用。

1.2.3.1植物精油配制。在無菌條件下，將植物精油用3%吐溫-80乳化劑溶液稀釋配制為500 mg/L精油溶液。

1.2.3.2真菌病原菌抑制試驗。用6 mm打孔器打取植物病原真菌菌餅移至PDA平板中央，在距菌餅約2 cm處等距離呈等邊三角形的3點打孔，每個孔內加100 μL樟樹葉精油溶液，每處理3次重復，以3%吐溫-80乳化劑溶液為陰性對照，不添加任何物質的處理為空白對照。所有處理平板放置28 ℃培養至空白對照菌落長滿，測量各處理的菌落直徑，計算抑制率[15]。抑制率=(空白對照菌落直徑-乳化劑處理菌落直徑-精油處理菌落直徑)/空白對照菌落直徑×100%。

1.3 數據處理方法采用SPSS 17.0 及Microsoft Excel 2007 軟件對試驗數據進行統計分析，試驗數據為平均值±標準差。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小顯著性差異法(LSD)多重比較檢驗不同處理之間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同化學型樟樹葉精油的化學成分分析通過對不同化學型樟樹葉精油GC-MS分析得到總離子流圖進行譜庫匹配和人工鑒定，使用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對含量，結果見表1。芳樟和龍腦樟2種精油經弱極性色譜柱分析鑒定出共52種化合物，精油成分組成以單萜類和倍半萜類為主，相對成分總含量分別99.31%、99.98%。

表1 2種不同化學型樟樹葉精油的GC-MS 分析結果

芳樟精油共分析鑒定出39種化合物，其中醇類化合物9種，相對含量為73.50%；烯類化合物24種，相對含量為18.97%，此外，還鑒定出1種烴類、1種苯類、2種酚類、1種醚類和1種酮類化合物。該化學型精油中相對含量超過1%的主要化學成分有芳樟醇(53.73%)、反式-橙花叔醇(8.87%)、蒿酮(4.46%)、桉葉油醇(4.45%)、石竹烯(4.12%)、樟腦(3.33%)、α-石竹烯(3.29%)、順β-羅勒烯(1.65%)、β-芘澄茄烯(1.49%)、α-松油醇(1.26%)、6-芹子烯-4-醇(1.09%)。

龍腦樟精油共分析鑒定出28種化合物，其中醇類化合物10種，相對含量為87.07%；烯類化合物12種，相對含量為9.63%，此外，還鑒定出1種烴類、1種酯類、3種酮類和1種酸類化合物。該化學型精油中相對含量超過1%的主要化學成分有龍腦(80.69%)、左旋乙酸冰片酯(2.84%)、α-石竹烯(2.46%)、石竹烯(2.18%)、氧化石竹烯(1.82%)、匙葉桉油烯醇(1.78%)、α-松油醇(1.41%)、樟腦(1.32%)、β-芹子烯(1.06%)。

2種化學型樟樹葉精油共同鑒定出的化合物為15種。其中，8種烯類(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、石竹烯、α-石竹烯、氧化石竹烯)，6種醇類(桉葉油醇、α-松油醇、樟腦、龍腦、松油烯-4-醇、芳樟醇)，1種烴類(β-傘花烴)。這些化學成分與前人研究報道的不同化學型樟樹的主要揮發性化合物一致[16]。芳樟精油中主要成分為芳樟醇，相對含量為53.73%。龍腦樟精油中主要成分為龍腦，相對含量為80.69%。

2.2 樟樹葉精油抑菌作用該試驗研究比較2種不同化學型樟樹葉精油在500 mg/L濃度下對玉米小斑病等10種植物真菌病原菌的抑菌活性，結果如表2和圖1～2所示。由表2和圖1可知，2種樟樹葉精油對甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌、冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻惡苗病菌8種病原菌均有不同程度的抑制作用，對蘋果輪紋病菌和小麥赤霉病菌無抑制作用。

圖1 2種不同化學型樟樹葉精油的抑制作用

表2 2種不同化學型樟樹葉精油對8種植物病原菌的抑菌菌落直徑

由圖2可知，2種樟樹葉精油對不同真菌的抑菌率相差較大。其中，芳樟精油對8種病原菌抑制率在11.51%～71.51%，對苦瓜枯萎病菌和甘蔗赤腐病菌的抑制率達70%以上；龍腦樟精油對8種病原菌抑制率在10.89%～63.54%，對甘蔗赤腐病菌的抑制率最高。2種精油除對玉米小斑病菌、冬瓜枯萎病菌、水稻惡苗病菌3種病菌的抑制作用無顯著差異外，芳樟精油對其余5種病原菌抑菌效果均顯著優于龍腦樟精油。此外，2種精油對甘蔗赤腐病菌均有較好的抑制作用。

注：不同小寫字母表示同種植物病原菌不同化學型樟樹葉精油間差異顯著(P<0.05)

3 結論與討論

樟樹是我國亞熱帶常綠闊葉林中的重要組成樹種，分布廣泛，資源豐富，其精油成分富含芳樟醇、樟腦、1，8-桉葉油素、龍腦、異橙花叔醇和黃樟油素等重要天然成分。精油是樟樹新陳代謝過程中次生代謝的產物，基因遺傳表達、生境共同作用會導致它產生復雜的遺傳變異，因種類、種植地、季節等因素的不同，樟樹葉精油的產油率、化學成分、理化性質都不同[17]。因此掌握樟樹精油的化學組成是對其進行開發利用的前提。該研究中芳樟、龍腦樟樹葉提取水蒸精油進行化學成分分析鑒定出52種化合物，精油成分組成以單萜類和倍半萜類為主。芳樟精油分析鑒定出39種化合物，其中醇類化合物9種、烯類化合物24種，主要成分為芳樟醇(53.73%)。龍腦樟精油分析鑒定出28種化合物，其中醇類化合物10種、烯類化合物12種，主要成分為龍腦(80.69%)。該研究中芳樟、龍腦樟樹葉采自廣東省，其化學成分分析結果與付宇新等[18]研究采自江西省的2種同化學型樟樹葉提取精油的分析結果不一致。而該研究中龍腦樟樹葉精油化學成分分析結果與丁雄等[19]研究同樣采自廣東省的龍腦樟樹葉精油的分析結果較為接近，主要成分龍腦的含量分別為80.69%和81.58%。這說明不同地區相同化學型的樟樹葉精油的主要成分存在一定的差異。

近年來，樟樹精油的生物活性研究備受關注。已有研究報道芳樟型和龍腦樟型樟樹精油具有良好的抑菌活性。丁雄等[19]研究發現龍腦樟葉水蒸揮發油及其主要成分右旋龍腦對試驗所選的細菌、酵母菌和霉菌3類微生物均表現出一定的抗菌效果。鄭紅富等[20]采用水蒸氣蒸餾法提取芳樟精油主要成分芳樟醇為 89.58%，采用菌絲生長速率法測試質量濃度為500、250和125 mg/L 時芳樟精油對水稻紋枯病菌具有良好的抑菌活性，抑制率分別為100%、90.88%和67.94%。目前，2種化學型樟樹精油對不同菌的殺菌作用研究較多，而2種化學型樟樹精油對同種菌抑制作用的比較還鮮少研究。該研究比較2種不同化學型樟樹精油在500 mg/L 濃度下對玉米小斑病等10種植物真菌病原菌的抑菌活性，2種樟樹精油對甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌、冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻惡苗病菌8種病原菌均有不同程度的抑制作用，對蘋果輪紋病菌和小麥赤霉病菌無抑制作用。2種精油除對玉米小斑病菌、冬瓜枯萎病菌、水稻惡苗病菌3種病菌的抑制作用無顯著差異外，芳樟精油對其余5種病原菌抑菌效果均顯著優于龍腦樟精油。該研究結果為芳樟和龍腦樟樟樹葉精油的開發利用提供理論依據。