基于高通量測序分析喙核桃內生真菌多樣性

張桂華李旦 何承忠

(1. 西南林業大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224；2. 西南林業大學林學院，云南 昆明 650224；3. 西南林業大學云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224；4. 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224)

喙核桃(Annamocarya sinensis)屬于胡桃科(Juglandaceae)喙核桃屬常綠喬木，是第三紀古熱帶孑遺植物[1]，為?全國極小種群野生植物保護實施方案?中保護物種，?中國植物紅皮書?中瀕危等級物種，2021年?國家重點保護野生植物名錄?中的二級保護植物。喙核桃僅在中國西南部和越南北部有分布，中國僅分布于貴州、廣西、云南[2]。喙核桃繁育困難，自我更新能力弱，野外分布范圍極其狹窄，多年來人為破壞嚴重，植株數量極少，極度瀕臨滅絕[3]，有必要對其展開多方面研究，以解決其瀕臨滅絕的問題。

植物內生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內部以及細胞間隙的微生物，可分為植物內生真菌、細菌及放線菌[4，5]。植物內生菌與宿主植物之間長期協同進化，形成互利共生關系，植物能提供內生菌生長所需的營養物質和生存空間，內生菌的一些代謝物質如生長激素、抗生素、分泌蛋白酶等可以促進植物的生長發育[6，7]，并且可以協助參與植物活性成分和次生代謝產物的合成，有些內生菌的代謝產物還可以增加宿主植物對外界惡劣環境的抗逆性及提高宿主植物的抗病性[8]。Wu 等[9]發現三七內生菌的豐富度大小影響植株正常發育；Fadaei 等[10]研究表明杜鵑花類菌根真菌能增強杜鵑花科植物的耐鹽性。

對植物內生真菌的分離主要是通過體外培養法純化得到。然而近年來的研究表明，傳統的純化培養法所鑒定的微生物僅占環境微生物總數的0.1%～10%[11]。有的內生菌不能在人工培養基上生長，是因人工培養基缺乏來自宿主植物的某些具有相互作用的活性物質，從而導致一些內生菌不可培養[12]。高通量測序技術是新一代測序方式，具有測序速度快、信息量大、準確率高的優點，將此技術應用于揭示微生物的物種和群落多樣性具有很強的優勢性[13]。

本課題組前期研究發現，喙核桃自身繁育困難，種子萌發率極低，無法通過嫁接、扦插等無性繁殖方法擴大種群數量，利用組織培養的方法對其展開腋芽誘導以及愈傷組織誘導發育成完整植株的試驗研究，均因內生真菌污染導致試驗失敗。本研究采用高通量測序技術對喙核桃幼嫩莖段和葉片中真菌rDNA ITS 基因進行提取并測序，結合生物信息學對喙核桃幼嫩莖段和葉片中內生真菌多樣性進行分析，探討喙核桃內生真菌的多樣性，以期為其內生真菌資源開發利用及其他研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2021年12月采摘課題組前期培育于西南林業大學苗圃的新鮮、健康、無蟲害喙核桃3年實生苗幼嫩莖段和葉片作為內生真菌測序所用試驗材料。

1.2 材料處理

莖段和葉片材料采集后迅速帶回實驗室，使用洗潔精溶液浸泡20 min，并用軟毛刷擦拭清理材料表面，之后流水沖洗6 h。將沖洗好的材料移至超凈工作臺上，進行不同消毒處理(表1)。

表1 材料預處理方法

詳細步驟為:(1)把莖段和葉片移入無菌培養瓶中，使用75%乙醇浸泡消毒5 s 后取出，用無菌水清洗3 次，每次2 min；(2)將莖段和葉片均分為18 等份，取出其中6 份材料裝入無菌凍存管－80℃冷凍保存，作為B 處理；(3)將余下12 份移入1%新潔爾滅溶液中，浸泡消毒1 min 后取出，用無菌水清洗3 次，每次2 min，再用0.1%氯化汞溶液消毒6 min 后取出，無菌水清洗6 次，每次2 min；(4)將完成消毒的莖段和葉片材料接種至DKW 培養基，(20 ± 3)℃條件下進行暗培養；(5)暗培養2 d 后，在超凈工作臺內取出6 份材料裝入無菌凍存管－80℃冷凍保存，作為A 處理；(6)暗培養14 d 后，在超凈工作臺內取出6 份材料，裝入無菌凍存管－80℃冷凍保存，作為C 處理。

1.3 樣品建庫測序

將凍存的樣品送北京百邁客生物科技有限公司做進一步建庫測序。具體流程如下:提取樣品總DNA 后，根據保守區設計引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR 擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000 進行測序。測序得到的原始圖像數據文件，經堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列(Sequenced Reads)，結果以FASTQ 文件格式存儲，其中包含測序序列(Reads)的序列信息以及其對應的測序質量信息。

1.4 信息分析流程

1.4.1 數據預處理 首先使用Trimmomatic v0.33軟件對測序得到的Raw Reads 進行過濾；然后使用cutadapt 1.9.1 軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads；使用Usearch v10 軟件，通過overlap 對每個樣品的Clean Reads 進行拼接，然后根據不同區域的長度范圍對拼接后數據進行長度過濾；使用UCHIME v4.2 軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據(Effective Reads)。

1.4.2 OTUs(Operational Taxonomic Units)分析使用Usearch 軟件對Reads 在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得OTUs。

1.4.3 物種注釋及分類學分析 以UNITE 為參考數據庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋，得到每個特征對應的物種分類信息，進而在各水平(門、綱、目、科、屬、種)統計各樣品群落組成，利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R 語言工具繪制樣品各分類學水平下的群落結構圖。

1.4.4 Alpha 多樣性指數分析 使用QIIME 2 軟件，對樣品Alpha 多樣性指數進行評估。

1.4.5 真菌生態功能預測分析 軟件FUNGuild(Fungi Functional Guild)是可用于解析真菌OTUs的工具，基于該軟件對樣品進行生態功能分析。

1.4.6 真菌關聯網絡分析 進行斯皮爾曼(Spearman)秩相關分析并篩選相關性大于0.1 且P值小于0.05的數據構建相關性網絡，并基于Python 繪制真菌相關性網絡圖。

2 結果與分析

2.1 內生真菌ITS 序列數量與OTUs 數量分布

18 個喙核桃樣品中，每個樣品至少產生477 021條質控序列，平均產生478 005 條質控序列。對所有樣本的有效序列以97%的一致性進行OTUs 聚類，然后對OTUs 序列進行物種注釋，共得到832 個序列，分屬于7 門、33 綱、78 目、163科、278 屬。物種豐度稀釋曲線上升到一定高度后趨于平穩(圖1)，表明測序的深度已足夠代表樣品中大多數真菌種類，Alpha 多樣性分析結果能夠代表物種的豐富度。

圖1 樣品稀釋曲線

Venn 圖用于統計多個樣本中所共有和獨有的OTUs 數目，可直觀地表現樣本的OTUs 數目組成相關性及重疊情況。由圖2 可知，從喙核桃莖段和葉片中檢測到的真菌共有OTUs 為686 個，特有OTUs 分別為114 個和32 個，分別占真菌總OTUs 的13.70%、3.85%。

圖2 真菌OTUs 分布Venn 圖

2.2 喙核桃莖段和葉片內生真菌群落多樣性和豐富度分析

ACE 或Chao 1 指數越大，表明群落的豐富度越高，從表2 可以看出，喙核桃內生真菌具有較高的豐富度。真菌ACE 指數均表現為莖段大于葉片。C 處理Chao 1 指數表現為葉片大于莖段，Chao 1 是度量物種豐富度的指標，其與豐度、均勻度無關，但是對稀有物種很敏感，推測葉片材料中某些稀有菌種在長時間組培條件下大量繁殖導致C 處理的Chao 1 指數升高。Shannon 指數和Simpson 指數是用來估算菌群多樣性的，Shannon指數越大，Simpson 指數越小，菌群多樣性越高，Shannon 指數對群落的豐富度以及稀有OTUs 更敏感，而Simpson 指數對均勻度和群落中的優勢OTUs 更敏感[14]。Shannon 指數在A 處理中表現為葉片小于莖段，B 處理中表現為葉片略大于莖段，C 處理中表現為葉片指數遠遠大于莖段，即自然狀態下，葉片的真菌多樣性略高于莖段，經過2 d 的組織培養后，莖段真菌多樣性高于葉片，但經過14 d 組織培養后，莖段真菌的多樣性遠遠低于葉片。Simpson 指數在A、B 處理中則表現為莖段大于葉片，即自然狀態和經過2 d 的組織培養條件下，內生真菌的均勻度均表現為葉片大于莖段，而經過14 d 組織培養后，莖段Simpson、Shannon指數降低，葉片的Simpson 指數略微增大，推測是由于莖段和葉片在長時間培養過程中某些稀有真菌急劇增長成為優勢菌屬所致。

表2 Alpha 多樣性指數分析

2.3 喙核桃莖段和葉片內生真菌群落結構

2.3.1 門水平群落結構 由圖3 可以看出，喙核桃葉片和莖段中內生真菌門類主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)及未鑒別的菌門(Unclassified)。其中，子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度在葉片和莖段中分別為65.43%和74.08%，為優勢菌門；其次是擔子菌門(Basidiomycota)，相對豐度分別為22.54%和12.40%；未得到分類學注釋的菌門相對豐度分別為8.86%和11.60%。

圖3 內生真菌門水平群落結構

2.3.2 屬水平群落結構 從圖4 可以看出，無論是莖段還是葉片，其屬水平豐度前15 的菌屬均為枝頂孢屬(Acremonium)、維希尼克酵母屬(Vishniacozyma)、枝孢屬(Cladosporium)、被孢霉屬(Mortierella)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、色二孢屬(Diplodia)、亞隔孢殼屬(Didymella)、鏈格孢屬(Alternaria)、酵母屬(Saccharomyces)、擲孢酵母屬(Sporidiobolus)、戈盧別夫氏酵母屬(Golubevia)、馬拉色菌屬(Malassezia)、莖點霉屬(Setophoma)、刺盤孢屬(Colletotrichum)，同時還有大量未被分類學注釋的菌屬。

圖4 莖段和葉片內生真菌屬水平群落結構

從圖5 可以看出，不同處理時期，各菌屬豐度占比具有明顯變化，自然狀態下(B 處理)，枝頂孢屬為喙核桃莖段中的優勢菌屬，其豐度占比高達51.80%，而在葉片中的豐度僅為1.74%；維希尼克酵母屬為喙核桃葉片中的優勢菌屬，豐度占比為14.12%，但其在莖段中的占比僅為9.99%。經過2 d 的組織培養后(A 處理)，莖段中豐度前15 的菌屬占比總體呈下降趨勢，僅占34.75%，與自然狀態下相比，下降34.45 個百分點；葉片中的維希尼克酵母屬豐度大幅增長，占比達24.77%，與自然狀態下相比，增長10.65 個百分點，豐度前15 的菌屬占比較自然狀態下增長16.44 個百分點。經過14 d 的組織培養后(C 處理)，枝頂孢屬和維希尼克酵母屬依舊為莖段和葉片中的優勢菌屬，較自然狀態，莖段中分別增長13.68 個百分點和9.21 個百分點，葉片中枝頂孢屬增長23.86 個百分點，維希尼克酵母屬則下降5.86 個百分點；一些菌屬則相對豐度大幅下降甚至消失，如莖段中亞隔孢殼屬。表明短期組織培養能降低部分菌屬的相對豐度，同時導致部分優勢菌屬急劇增長，經過長期組織培養后，部分優勢菌屬急劇生長占據主要生態位和微生態環境，導致其他菌屬相對豐度降低，甚至消失。此外，喙核桃內生真菌在屬水平上仍有較多的菌屬未能被鑒定。

圖5 不同處理下莖段和葉片內生真菌屬水平群落結構

2.4 喙核桃莖段和葉片真菌的生態功能預測

對3 個處理的喙核桃莖段和葉片樣本進行FUNGuild 真菌功能預測，結果表明，喙核桃莖段中3 種基本營養型豐度占比分別為共生營養型占15.28%、腐生營養型占49.90%、病理營養型占34.82%，葉片的3 種基本營養型占比為共生營養型占11.25%、腐生營養型占48.93%、病理營養型占39.82%。由圖6 可知，根據Guilds 小類，又分為植物病原菌(Plant Pathogen)、動物病原菌(Animal Pathogen)、真菌寄生菌(Fungal Parasite)、植物內生菌(Endophyte)、植物腐生菌(Plant Saprotroph)、木腐生真菌(Wood Saprotroph)、糞腐生真菌(Dung Saprotroph)、外生菌根真菌(Ectomycorrhizal)、叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal)、土壤腐生菌(Soil Saprotroph)、動物寄生蟲(Animal Parasite)、動物共生真菌(Animal Endosymbiont)、附生真菌(Epiphyte)、杜鵑花類菌根真菌(Ericoid Mycorrhizal)及未定義腐生菌。其中，植物病原菌在自然狀態(B 處理)的葉片樣本中占比最高，為36.40%，在莖段樣本中占比25.26%；組織培養2 d 后(A 處理)，其占比最多下降21.37個百分點；經過14 d 組織培養后(C 處理)，與B處理比較，至多增長7.30 個百分點，但其豐度始終低于自然狀態下。其次，未定義的腐生菌、糞腐生菌、動物病原菌在自然狀態下的相對豐度低于經過組培處理后的；植物內生菌、土壤腐生菌的相對豐度經過組培處理后明顯升高，動物共生真菌相對豐度經過組培處理后明顯降低。

圖6 真菌生態功能預測

2.5 真菌網絡關系

以相關性最高的前50 個屬繪制真菌網絡關聯圖，從圖7可以看出枝頂孢屬的平均豐度遠大于其他屬，每個屬在平均豐度上均存在一個甚至多個與其存在關聯的屬。除外囊菌屬(Taphrina)與Archaeorhizomyces、尾孢菌屬(Cercospora)與蠟殼菌屬(Sebacina)、枝頂孢屬(Acremonium)與黑團孢屬(Periconia)、裂殼屬(Schizothecium)與枝鼻菌屬(Cladorrhinum)等少數幾個屬間呈負相關關系外，其余大多數屬間呈正相關關系，如煤炱屬(Capnodium) 與Scolecoxyphium、擬魏克酵母屬(Wickerhamiella) 與毛孢子菌屬(Cutaneotrichosporon) 等。該關聯網絡具有較高的模塊度(0.417)和平均聚類系數(0.318)。

圖7 真菌網絡關系(屬水平)

3 討論與結論

本研究首次采用高通量測序方法對喙核桃莖段和葉片內生真菌的多樣性與群落結構展開分析，以97%的一致性進行OTUs 聚類，共得到內生真菌OTUs 832 個，分屬于7 門、33 綱、78 目、163科、278 屬。分析結果顯示喙核桃內生菌具有高豐富度和多樣性，自然狀態下喙核桃莖段真菌豐富度高于葉片，但多樣性低于葉片，經過長期組織培養后，莖段中的優勢真菌屬急劇增長，導致莖段整體真菌群落多樣性大幅度下降，而葉片中真菌群落多樣性在組織培養后增高，表明喙核桃內生真菌分布具有隨環境改變而變化、不同組織分布不同的特點，與惠建超[15]、臧威[16]等研究得到的內生真菌群落在不同環境以及根、莖、葉中分布具有明顯差異的結論一致。

從門水平群落結構看，喙核桃葉片和莖段中內生真菌主要包括子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門、球囊菌門、羅茲菌門、油壺菌門等，其中子囊菌門為優勢菌門，擔子菌門為亞優勢菌門。據McInroy 等[17]研究發現，大多數植物內生真菌以子囊菌門和擔子菌門為主，這與本研究結果一致。Beinforde 等[18]研究表明子囊菌門大多數為腐生菌，可以分解難降解性有機質，在養分循環中起著重要作用，作為喙核桃內生優勢真菌的子囊菌門真菌在其養分循環中同樣起重要作用。從屬水平群落結構看，豐度前15 的菌屬包括枝頂孢屬、維希尼克酵母屬、枝孢屬、被孢霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、莖點霉屬等，其中枝頂孢屬、維希尼克酵母屬為優勢菌屬。張向月[19]、周麗思[20]等研究表明，枝頂孢屬、枝孢屬具有促生、抗逆、抗病害和產活性代謝產物等功能。枝頂孢屬、維希尼克酵母屬為喙核桃的優勢菌屬，可能也具有相應功能。Broeckling 等[21]研究認為被孢霉屬相較其他真菌更易在貧瘠生境中生長，從而導致其相對豐度較其他類群真菌高，推測是其在喙核桃植株內有高豐度的原因。de Oliveira Rocha 等[22]研究表明鐮刀菌可造成植物根、莖、葉的腐爛萎蔫，引起苗枯、穗腐、植物種子和塊莖的腐爛等；于莉等[23]研究表明莖點霉屬真菌是一種重要的病原菌，有強烈的纖維素酶活性，會引起植物的莖腐、枝枯癥狀，這些菌屬是導致組培試驗中材料污染、死亡及腐爛的主導因素。

喙核桃莖段和葉片中的真菌以腐生營養型為主，平均相對豐度分別為49.41%，其次為病理營養型(37.32%)，而共生營養型的平均相對豐度較低，僅為13.26%。在Guilds 小類中，發現植物病原菌在自然狀態的葉片樣本中占比最高，在已知的植物病害中，70%～80%是由植物病原真菌引起的[24]，推測其是喙核桃幼苗在野外條件下存活率低的原因之一，同時也是導致組培試驗失敗的致病真菌。石晶盈等[25]研究發現感染內生菌的植株往往比未感染內生菌的植株更具生存競爭力，并表現出生長快速、抗病害、抗動物危害等生存優勢；Huang 等[26]研究發現具有菌根真菌定植的植物可能因其真菌共生體提高10%～20%的光合作用效率；曲躍軍等[27]研究發現叢枝菌根真菌可以作為因傷害引起的植物病原體的生物防治真菌，還可以利用其代謝物質提高農作物的效率。外生菌根真菌菌絲體既可以增加植物根系吸收面積來增強植物獲取水分和營養的能力，還可以提高作物對干旱、重金屬、病蟲害的抵抗力[28]，推測這些真菌在喙核桃植株內具有一定的促生長發育和增強抗逆、抗病能力。此外，動物病原菌、真菌寄生菌、動物寄生蟲、動物共生真菌等也被檢測出來，其與各種腐生菌和寄生菌組成了多功能的營養型。

喙核桃內生真菌具有較高豐富度和多樣性，且有較多的菌屬及菌種未能被鑒定，說明喙核桃植物的內生真菌還有很廣的研究面，值得繼續深入研究。子囊菌門為其優勢菌門，豐度占比最高達74.08%，枝頂孢屬、維希尼克酵母屬為其優勢菌屬和亞優勢菌屬，經組織培養處理后，能降低部分真菌的相對豐度，但不能使其滅亡，同時還會導致優勢菌屬相對豐度的急劇增長。真菌以腐生營養型為主，平均相對豐度達49.41%，真菌生態功能群包括植物病原菌、動物病原菌、真菌寄生菌、植物內生菌、植物腐生菌、木腐生菌、糞腐生真菌、外生菌根真菌、叢枝菌根真菌、土壤腐生菌、動物寄生蟲、動物共生真菌、附生植真菌、杜鵑花類菌根及未定義腐生菌。真菌網絡關系顯示每個屬在平均豐度上均存在一個甚至多個與其存在關聯的屬，除少數幾個屬間呈負相關關系，其余大多數屬間呈正相關關系。

致謝:本研究依托西南林業大學云南生物多樣性研究院完成。